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生化实验讲义(理论部分)二--生物大分子的制备

更新:2005-12-31 来源:Internet 作者:未知 【
之,对样品的保存必须给以只够的重视,一些常用酶的保存条件可参见《生物化学制备技术》(苏拔贤主编)一书中的“一些酶保存的条件和稳定性”表,其他各种生物大分子和生物制剂的保存条件,可查阅有关的文献和酶学手册。
2.3.6 分离纯化方法的选择
  生物大分子能否高效率地制备成功,关键在于分离纯化方案的正确选择和各个分离纯化方法实验条件的探索。选择与探索的依据就是生物大分子与杂质之间的生物学和物理化学性质上的差异。由本章前述的生物大分子制备的各种特点可以看出,分离纯化方案必然是千变万化的。
  制备生物大分子的方法可以粗略地分类如下:① 以分子大小和形态的差异为依据的方法:差速离心、区带离心、超滤、透析和凝胶过滤等。② 以溶解度的差异为依据的方法:盐析、萃取、分配层析、选择性沉淀和结晶等。③ 以电荷差异为依据的方法:电泳、电渗析、等电点沉淀、吸附层析和离子交换层析等。④ 以生物学功能专一性为依据的方法:亲和层析等。
在分离纯化流程中,早期和晚期的分离纯化方法的选择有明显的不同:
  ⑴ 早期分离纯化
1) 特点:①粗提取液中物质成份十分复杂。②欲制备的生物大分子浓度很稀。
③物理化学性质相近的物质很多。④希望能除去大部分与目的产物物理化学性质差异大的杂质。
  2) 对所选方法的要求:①要快速、粗放。②能较大地缩小体积。③分辨力不必太高。④负荷能力要大。
  3) 可选用的方法:吸附;萃取;沉淀法(热变性、盐析、有机溶剂沉淀等);离子交换(批量吸附、胖柱交换);亲和层析等。
  ⑵晚期分离纯化                
   1) 可选用的方法:吸附层析、盐析、凝胶过滤、离子交换层析、亲和层析、等电聚焦制备电泳、制备HPLC等。
   2)要注意的一些问题:
   ①盐析后要及时脱盐。
   ②用凝胶过滤时如何缩小上样体积,因为凝胶层析柱的上样体积只能是柱床体积的1/10~1/6,也可以使用串联柱以加大柱床体积。
   ③必要时也可以重复使用同一种分离纯化方法,例如分级有机溶剂沉淀,分级盐析,连续两次凝胶过滤或离子交换层析等。
   ④分离纯化步骤前后要有科学的安排和衔接,尽可能减少工序,提高效率。例如吸附不可以放在盐析之后,以免大量盐离子影响吸附效率;离子交换要放在凝胶过滤之前,因为离子交换层析的上样量可以不受限制,只要不超过柱交换容量即可。
   ⑤分离纯化后期,目的产物的纯度和浓度都大大提高,此时对于很多敏感的酶极易变性失活,因此操作步骤要连续、紧凑,尽可能在低温下(如在冷室中)进行。
   ⑥得到最终产品后,必要时要立即冰冻干燥,分装并写明标签,-20℃ 或
-70℃保存。

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