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邮件订阅杂交试验中用于降低背景的封闭剂
|
试剂 |
用途 |
| Denhardt试剂 | Northern杂交 |
| 使用RNA探针的杂交 | |
| 单拷贝序列的Southern杂交 | |
| 将DNA固定于尼龙膜上的杂交 | |
| Denhardt试剂通常配制50×贮存液，过滤后保存于-20℃。可将该贮存液10倍稀释于预杂交液（常为含有0.5%SDS和100μg/ml经变性被打断的鲑精DNA的6×SSC或6×SSPE）中。50×Denhardt液中含5g聚蔗糖（Ficoll,400型，Pharmacia）、5g聚乙烯吡咯烷酮和5g牛血清白蛋白（组分V”Sigmal），加水至终体积为500ml。 | |
| BLOTTO | Grunstein-Hogness杂交 |
| Benton-Davis杂交 | |
| 除单拷贝序列Southern杂交以外的所有Southern杂交 | |
| 斑点印迹 | |
| 1×BLOTT（牛乳转移技术优化液，Bovine Lacto Transfer Technique Optimizer）,是含5%胶脂奶粉和0.02%叠氮钠的水溶液，应保存于4℃。使用前可用预杂交液稀释25倍。BLOTTO不应与高浓度的SDS并用，因为后者会导致牛奶中蛋白质析出。如果杂交背景不合要求，可在杂交液中加入NP-40至终浓度为1%。BLOTTO不能用作Northern杂交的封闭剂，因为这一封闭剂中可能含有RNA酶，其活性之高使人无法接受。 | |
| 注意：叠氮钠有毒性，取用时需戴手套小心操作。含叠氮钠的溶液应予明确标记。 | |
| 肝素 | Southern杂交 |
| 原位杂交 | |
| 肝素（Sigma H-7005，从猪中提取的二级产品或相当等级的产品）用4×SSPE或4×SSC溶解配制成50mg/ml的浓度，保存于4℃。肝素在含有葡聚糖硫酸酯的杂交液中用作封闭剂的浓度为500μg/ml，在不含葡聚糖硫酸酯的杂交液中的浓度为50μg/ml。 | |
| 经变性并被打断的鲑精DNA | southern和Northern杂交 |
| 把鲑鱼精子DNA（Sigma,Ⅲ,盐钠）溶解于水配制成10mg/ml的浓度，必要时于室温磁力搅拌2～4h助溶。把溶液中NaCl的浓度调至0.1mol/L，并用酚和酚/氯仿各抽提一次，回收水相。合DNA溶液快速通17号皮下注射针头12次，以剪切DNA。加入2倍体积用冰预冷的乙醇沉淀DNA。离心回收DNA并重溶于水，配制成10mg/ml的浓度，测定溶液的OD260值并计算出精确的DNA浓度，然后煮沸10min，分装成小份保存于-20℃。使用前置沸水浴中加热5min，然后迅速在冰浴中骤冷。预杂交液中应含有100μg/ml经变性并被打断的鲑鱼精子DNA | |
六、常用凝胶的技术参数
1．葡聚糖凝胶的某些技术数据
种类 |
干颗粒直径（μ） |
分子量分级范围 |
床体积毫升/克干分子筛 |
得水值 |
溶胀最少平衡时间（h） | 柱头压力（kPa）(2.5cm直径柱) | ||
| 肽及球形蛋白质 | 葡聚糖（线性分子） | 室温 | 沸水浴 | |||||
| Sephadex G-10 | 40～ 120 | ～700 | ～700 | 2～ 3 | 1.0±0.1 | 3 | 1 | |
| Sephadex G-10 | 40～ 120 | ～1500 | 1500 | 2.5～3.5 | 1.5±3.5 | 3 | 1 | |
| Sephadex G-25 | ||||||||
|
粗级 |
100～300
(≈5～100目) |
|||||||
|
中级 |
50～150
(≈100～200目) |
1,000～ 5,000 |
100～ 5,000 |
4～6 |
1.5±0.2 |
6 |
2 |
|
|
细级 |
20～800(≈200～400目) | |||||||
|
超细 |
10～40 | |||||||
| Sephadex G-50 | ||||||||
|
粗级 |
100～200 | |||||||
|
中级 |
50～150 | 1,500～ | 500～ | |||||
|
细级 |
20～80 | 30,000 | 10,000 | 9～11 | 5.0±0.3 | 6 | 2 | |
|
超细 |
10～40 | |||||||
| Sephadex G-75 | ||||||||
| 40～120 | 3,000～ | 1,000～ | ||||||
|
超细 |
10～40 | 70,000 | 950,000 | 12～15 | 7.5±0.5 |
24 |
3 |
3.92～15.86 |
| Sephadex G-100 | ||||||||
| 40～120 | 4,000～ | 1,000～ | ||||||
|
超细 |
10～40 | 1,500,000 | 150,000 | 15～20 | 10.0±1.0 | 48 | 5 | 2.35～9.41 |
| Sephadex G-150 | ||||||||
| 40～120 | 5,000～ | 1,000～ | 20～30 | |||||
|
超细 |
10～40 | 400,000 | 150,000 | 18～22 | 15.0±1.5 | 72 | 5 | 0.88～3.53 |
| Sephadex G-200 | ||||||||
| 40～120 | 5000～ | 1000～ | 30～40 | |||||
| 10～40 | 800,000 | 200,000 | 20～25 | 20.0±2.0 | 72 | 5 | 0.39～1.57 | |
2.聚丙烯酰胺凝胶的技术数据
|
型号 |
排阻的下限 (分子量) |
分级分离范围 (分子量) |
膨胀后的床体积(ml/g干凝胶) |
膨胀所需最少时间(室温,h) |
| Bio-gel-P-2 | 1,600 | 200～2,000 |
3.8 |
2～4 |
| Bio-gel-P-4 | 3,600 | 500～4,000 |
5.8 |
2～4 |
| Bio-gel-P-6 | 4,600 | 1,000～5,000 |
8.8 |
2～4 |
| Bio-gel-P-10 | 10,000 | 5,000～17,000 |
12.4 |
2～4 |
| Bio-gel-P-30 | 30,000 | 20,000～50,000 |
14.9 |
10～12 |
| Bio-gel-P-60 | 60,000 | 30,000～70,000 |
19.0 |
10～12 |
| Bio-gel-P-100 | 100,000 | 40,000～100,000 |
19.0 |
24 |
| Bio-gel-P-150 | 150,000 | 50,000~150,000 |
24.0 |
24 |
| Bio-gel-P-200 | 200,000 | 80,000～200,000 |
34.0 |
48 |
| Bio-gel-P-300 | 300,000 | 100～400,000 |
40.0 |
48 |
3．琼脂糖凝胶的技术数据
|
型号 |
琼脂糖含量 %（W/W） |
排阻的下限 （分子量） |
分级分离的范围（分子量） |
生产厂家 |
| Sepharose 4B | 4 | 0.3×106～3×106 | Pharmacia | |
| Sepharose 2B | 2 | 2×106～25×106 | ||
| Sagavac 10 | 10 | 2.5×105 | 1×104～2.5×105 | Seravac |
| Sagavac 8 | 8 | 7×105 | 2.5×104～7×105 | |
| Sagavac 6 | 6 | 2×106 | 5×104～2×106 | |
| Sagavac 4 | 4 | 15×106 | 2×105～15×106 | |
| Sagavac 2 | 2 | 150×106 | 5×105～15×107 | |
| Bio-gel A-0.5M | 10 | 0.5×106 | <1×104～0.5×106 | Bio-Rad |
| Bio-gel A-1.5M | 8 | 1.5×106 | <1×104～1.5×106 | |
| Bio-gel A-5M | 6 | 5×106 | 1×104～5×106 | |
| Bio-gel A-15M | 4 | 15×106 | 4×104～15×106 | |
| Bio-gel A-50M | 2 | 50×106 | 1×105～50×106 | |
| Bio-gel A-150M | 1 | 150×106 | 1×106～150×106 |
4．各处凝胶所允许的最大操作压
|
凝胶 |
最大静水压（kPa） |
|
Sephadex |
|
|
G-10 |
9.8 |
|
G-15 |
9.8 |
|
G-25 |
9.8 |
|
G-50 |
9.8 |
|
G-75 |
4.9 |
5．琼脂糖凝胶浓度与线性DNA分辨范围
|
凝胶浓度（%） |
线性DNA长度（bp） |
|
0.5 |
1000～30000 |
|
0.7 |
800～12000 |
|
1.0 |
500～10000 |
|
1.2 |
400～7000 |
|
1.5 |
200～3000 |
|
2.0 |
50～2000 |
6．染料在变性聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速度
|
凝胶浓度（%） |
溴酚蓝 |
二甲苯青FF |
|
5．0 |
35bp |
140bp |
|
6．0 |
26bp |
106bp |
|
8．0 |
19bp |
75bp |
|
10．0 |
12bp |
55bp |
|
20．0 |
8bp |
28bp |
7．染料在非变性聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速度
|
凝胶浓度（%） |
溴酚蓝 |
二甲苯青FF |
|
3.5 |
100bp |
460bp |
|
5.0 |
65bp |
260bp |
|
8.0 |
45bp |
160bp |
|
12.0 |
20bp |
70bp |
|
15.0 |
15bp |
50bp |
|
20.0 |
12bp |
45bp |
七、氨基酸的特性
| 氨基酸名称 | 三字母缩写 | 单字母缩写 |
质量 |
侧链电离的pHa值 |
结构式 |
| 丙氨酸（alanine） | Ala | A | 89.09 |  | |
| 精氨酸（arginine） | Arg | R | 174.2 | 12.48 |  |
| 天冬酰氨（asparagine） | Asn | N | 132.1 |  | |
| 天冬氨酸（aspartic acid） | Asp | D | 133.1 | 3.86 |  |
| 半胱氨酸（systeine） | Cys | C | 121.12 |  | |
| 谷氨酰胺（glutamine） | Gln | Q | 146.15 |  | |
| 谷氨酸（glutamic acid） | Glu | E | 147.13 | 4.25 |  |
| 甘氨酸（glycine） | Gly | G | 75.07 |  | |
| 组氨酸（histidine） | His | H | 155.16 | 6.0 |  |
| 异亮氨酸（isoleucine） | lle | I | 131.17 |  | |
| 亮氨酸（leucine） | Leu | L | 131.17 |  | |
| 赖氨酸（lycine） | Lys | K | 146.19 |  | |
| 甲硫氨酸（methionine） | Met | M | 149.21 |  | |
| 苯丙氨酸（phenylanaline） | Phe | P | 165.19 |  | |
| 脯氨酸（proline） | Pro | P | 115.13 |  | |
| 丝氨酸（serine） | Ser | S | 105.06 |  | |
| 苏氨酸(threonine) | Thr | T | 119.12 |  | |
| 色氨酸（tryptophan） | Trp | W | 204.22 | ||
| 酪氨酸（tyrosine） | Tyr | Y | 181.19 | 10.07 |  |
| 缬氨酸（valine） | Val | P | 117.15 |  |
八、遗传密码
密码子的第二位
| 密码子的第一位（5’端） |
U |
C |
A |
G |
密码子的第三位（3端’） | ||||||
U |
UUU | Phe | UCU | Ser | UAU | Tyr | UGU | Gys | U | ||
| UUC | Phe | UCC | Ser | UAC | Tyr | UGG | Gys | C | |||
| UUA | Leu | UCA | Ser | UAA | 终止（赭石） | UGA | 终止（乳白） | A | |||
| UUG | Leu | UGG | Ser | UAG | 终止（琥珀） | UGG | Trp | G | |||
C |
CUU | Leu | CCU | Pro | CAU | His | CGA | Arg | U | ||
| CUC | Leu | CCC | Pro | CAC | His | CGC | Arg | C | |||
| CUA | Leu | CCA | Pro | CAA | Gln | CGA | Arg | A | |||
| CUG | Leu | CCG | Pro | CAG | Gln | CGC | Arg | G | |||
A |
AUU | Ile | ACU | Thr | AAU | Asn | AGU | Ser | U | ||
| AUC | Ile | ACC | Thr | AAC | Asn | AGC | Ser | C | |||
| AUA | Ile | ACA | Thr | AAA | Lys | AGA | Arg | A | |||
| AUG | Met | ACG | Thr | AAG | Lys | AGC | Arg | G | |||
G |
GUU | Val | GCU | Ala | GAU | Asp | GGU | Gly | U | ||
| GUC | Val | GCC | Ala | GAC | Asp | GGC | Gly | C | |||
| GUA | Val | GCA | Ala | GAA | Glu | GGA | Gly | A | |||
| GUG | Val | GCG | Ala | GAG | Glu | GGG | Gly | G | |||
九、常用酸碱技术参数
1．常见的市售酸碱的浓度
| 溶质 | 分子式 | 分子量 | mol/L | g/L | 重量（%） | 比重 | 配制mol/L溶液的加入量（ml/L） |
| 冰乙酸 | CH3COOH | 60.05 | 17.40 | 1045 | 99.5 | 1.050 | 57.5 |
| 乙酸 | 60.05 | 6.27 | 376 | 36 | 1.045 | 159.5 | |
| 甲酸 | HCOOH | 46.02 | 23.40 | 1080 | 90 | 1.200 | 42.7 |
| 盐酸 | HCl | 36.50 | 11.60 | 424 | 36 | 1.180 | 86.2 |
| 2.90 | 105 | 10 | 1.050 | 344.8 | |||
| 硝酸 | HNO3 | 63.02 | 15.99 | 1008 | 71 | 1.420 | 62.5 |
| 14.90 | 938 | 67 | 1.400 | 67.1 | |||
| 13.30 | 837 | 61 | 1.370 | 75.2 | |||
| 高氯酸 | HclO3 | 100.50 | 11.65 | 1172 | 70 | 1.670 | 85.8 |
| 9.20 | 923 | 60 | 1.540 | 108.7 | |||
| 磷酸 | H2PO4 | 80.00 | 18.10 | 1445 | 85 | 1.700 | 55.2 |
| 硫酸 | H2P｀O4 | 98.10 | 18.00 | 1776 | 96 | 1.840 | 55.6 |
| 氢氧化铵 | NH4OH | 35.00 | 14.80 | 251 | 28 | 0.898 | 67.6 |
| 氢氧化钾 | KOH | 56.10 | 13.50 | 757 | 50 | 1.520 | 74.1 |
| 1.94 | 109 | 10 | 1.090 | 515.5 | |||
| 氢氧化钠 | NaOH | 40.00 | 19.10 | 763 | 50 | 1.530 | 52.4 |
| 2.75 | 111 | 10 | 1.110 | 363.4 |
2．各种浓度的酸碱贮存液的近似pH值
| 溶质 | 1Na | 0.1Na | 0.01Na | 0.001Na |
| 乙酸 | 0.40 | 2.90 | 3.40 | 3.90 |
| 盐酸 | 0.10 | 1.07 | 2.02 | 3.01 |
| 硫酸 | 0.30 | 1.20 | 2.10 | |
| 柠檬酸 | 2.10 | 2.60 | ||
| 氢氧化铵 | 11.80 | 11.30 | 10.80 | 10.30 |
| 氢氧化钠 | 14.05 | 13.07 | 12.12 | 11.13 |
| 碳酸氢钠 | 8.40 | |||
| 碳酸钠 | 11.50 | 11.00 |
J a.N为光量浓度[1N≈（1mol/L）×离子价数]。
