在线投稿
投稿指南
RSS订阅
邮件订阅按照这些要求可以设计和选择最为合适的缓冲剂来配制所需的缓冲溶液。
7.2 生物化学常用缓冲液
⑴ 磷酸盐缓冲液
磷酸盐是生物化学研究中使用最广泛的一种缓冲剂，由於它们是二级解离，有二个pKa值，所以用它们配制的缓冲液，pH范围最宽：
NaH2PO4： pKa1＝2.12， pKa2＝7.21
Na2HPO4： pKa1＝7.21， pKa2＝12.32
配酸性缓冲液： 用 NaH2PO4，pH＝1～4，
配中性缓冲液： 用混合的两种磷酸盐，pH＝6～8，
配碱性缓冲液： 用 Na2HPO4，pH＝10～12。
用钾盐比钠盐好，因为低温时钠盐难溶，钾盐易溶，但若配制SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的缓冲液时，只能用磷酸钠而不能用磷酸钾，因为SDS（十二烷基硫酸钠）会与钾盐生成难溶的十二烷基硫酸钾。
磷酸盐缓冲液的优点为：①容易配制成各种浓度的缓冲液；②适用的pH范围宽；③pH受温度的影响小；④缓冲液稀释后pH变化小，如稀释十倍后pH的变化小于0.1。
其缺点为：①易与常见的钙Ca++离子、镁Mg++离子以及重金属离子缔合生成沉淀；②会抑制某些生物化学过程，如对某些酶的催化作用会产生某种程度的抑制作用。
⑵Tris（三羟甲基氨基甲烷，N-Tris(hydroxymethyl)aminomethane）缓冲液
Tris缓冲液在生物化学研究中使用的越来越多，有超过磷酸盐缓冲液的趋势，如在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中已都使用Tris缓冲液，而很少再用磷酸盐。
Tris缓冲液的常用有效pH范围是在“中性”范围，例如：
Tris-HCl缓冲液： pH＝7.5～8.5
Tris-磷酸盐缓冲液： pH＝5.0～9.0
配制常用的缓冲液的方法有两种：①按书后附录中所列该缓冲液表中的方法，分别配制0.05mol/L Tris和0.05mol/L HCl溶液，然后按表中所列体积混合。由于标准浓度的稀盐酸不易配制，所以常用另一种方法；②若配1L 0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液：先称12.11g Tris碱溶于950mL～970mL 无离子水中，边搅拌边滴加4N HCl，用pH计测定溶液pH值至所需的pH值，然后再加水补足到1L。
Tris-HCl缓冲液的优点是： ①因为Tris碱的碱性较强，所以可以只用这一种缓冲体系配制pH范围由酸性到碱性的大范围pH值的缓冲液；②对生物化学过程干扰很小，不与钙、镁离子及重金属离子发生沉淀。
其缺点是：①缓冲液的pH值受溶液浓度影响较大，缓冲液稀释十倍，pH值的变化大于0.1；②温度效应大，温度变化对缓冲液pH值的影响很大，即：
△pKa／℃＝－0.031 ，例如：4℃时缓冲液的pH＝8.4，则37℃时的pH＝7.4，所以一定要在使用温度下进行配制，室温下配制的Tris-HCl缓冲液不能用于0℃～4℃。 ③易吸收空气中的CO2，所以配制的缓冲液要盖严密封。 ④此缓冲液对某些pH电极发生一定的干扰作用，所以要使用与Tris溶液具有兼容性的电极。
⑶ 有机酸缓冲液
这一类缓冲液多数是用羧酸与它们的盐配制而成，pH范围为酸性，即pH＝3.0～6.0，最常用的是甲酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸等。
甲酸～甲酸盐缓冲液很有用，因其挥发性强，使用后可以用减压法除之。乙酸～乙酸钠和柠檬酸～柠檬酸钠缓冲体系也使用的较多，柠檬酸有三个pKa值：pKa1＝3.10，
pKa2＝4.75， pKa3＝6.40。琥珀酸有二个pKa值：pKa1＝4.18， pKa2＝5.60。
有机酸缓冲液的缺点是：①所有这些羧酸都是天然的代谢产物，因而对生化反应过程可能发生干扰作用；②柠檬酸盐和琥珀酸盐可以和过渡金属离子（Fe3+、Zn++、Mg++等）结合而使缓冲液受到干扰；③这类缓冲液易与Ca++离子结合，所以样品中有Ca++离子时，不能用这类缓冲液。
⑷ 硼酸盐缓冲液
常用的有效pH范围是：pH＝8.5～10.0，因而它是碱性范围内最常用的缓冲液，其优点是配制方便，只使用一种试剂，缺点是能与很多代谢产物形成络合物，尤其是能与糖类的羟基反应生成稳定的复合物而使缓冲液受到干扰。
⑸ 氨基酸缓冲液
此缓冲液使用的范围宽，可用于pH=2.0～11.0，例如最常用的有：
甘氨酸—HCl缓冲液：pH=2.0～5.0，
甘氨酸—NaOH缓冲液：pH=8.0～11.0，
甘氨酸—Tris缓冲液：pH=8.0～11.0，（此缓冲液用于广泛使用的SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳的电极缓冲液），
组氨酸缓冲液：pH=5.5～6.5，
甘氨酰胺（glycine amide）缓冲液：pH=7.8～8.8，
甘氨酰甘氨酸（glycylglycine）缓冲液：pH=8.0～9.0。
此类缓冲体系的优点是：为细胞组份和各种提取液提供更接近的天然环境。其缺点是：①与羧酸盐和磷酸盐缓冲体系相似，也会干扰某些生物化学反应过程，如代谢过程等。②试剂的价格较高。
⑹ 两性离子缓冲液（Zwitterionic buffers），又称Good’s缓冲液
1960年，N.E.Good和他的同事们总结了现有的各种缓冲试剂的优缺点后认为，必须用人为设计和人工合成的方法来找到专门用于生命科学研究的特定的缓冲体系，这些缓冲体系应具有前面所述的九条要求和特性。他们合成的一系列Good’s缓冲液可查阅有关的资料。
Good’s缓冲液的主要优点是不参加和不干扰生物化学反应过程，对酶化学反应等无抑制作用，所以它们专门用于细胞器和极易变性的、对pH敏感的蛋白质和酶的研究工作。其缺点是：①价格昂贵，②对测定蛋白质含量的双缩脲法和Lowry法不适用，因为它们会使空白管的颜色加深。
8. pH值的测定
测定溶液pH值通常有两种方法，最简便但较粗略的方法是用pH试纸，分为广泛和精密pH试纸两种。广泛pH试纸的变色范围是pH=1～14、9～14等，只能粗略确定溶液的pH值。另一种是精密pH试纸，可以较精确地测定溶液的pH值，其变色范围是2～3个pH单位，例如有pH=1.4～3.0、0.5～5.0、5.4～7.0、7.6～8.5、8.0～10.0、9.5～13.0等许多种，可根据待测溶液的酸、碱性选用某一范围的试纸。测定的方法是将试纸条剪成小块，用镊子夹一小块试纸（不可用手拿，以免污染试纸），用玻璃棒蘸少许溶液与试纸接触，试纸变色后与色阶板对照，估读出所测pH值。切不可将试纸直接放入溶液中，以免污染样品溶液。也可将试纸块放在白色点滴板上观察和估测。试纸要存放在有盖的容器中，以免受到实验室内各种气体的污染。
精确测定溶液pH值要使用pH计，其精确度可达0.005pH单位，关键是要正确选用和校对pH电极。过去是使用两个电极，即玻璃电极和参比电极（甘汞或银—氯化银电极），现在它们已淘汰，被两种电极合一的复合电极所代替。
玻璃电极对溶液中的氢离子浓度敏感，其头部为一薄玻璃泡，内装有0.1N HCl，上部由银～氯化银电极与铂金丝联结。当玻璃电极浸入样品溶液时，薄玻璃泡内外两侧的电位差取决于溶液的pH，即玻璃电极的电极电位随样品溶液中氢离子浓度（活度）的变化而变化。
参比电极的功能是提供一个恒定的电位，作为测量玻璃电极薄玻璃泡内外两侧电位差的参照。常用的参比电极是甘汞电极（Hg/HgCl）或银—氯化银电极（Ag/AgCl）。参比电极电位是氯离子浓度的函数，因而电极内充以4M KCl或饱和KCl，以保持恒定的氯离子浓度和恒定的电极电位。使用饱和KCl是为使电极内沉积有部分KCl结晶，以使KCl的饱和浓度不受温度和湿度的影响。
现在pH测定已都改用玻璃电极与参比电极合一的复合电极，即将它们共同组装在一根玻璃管或塑料管内，下端玻璃泡处有保护罩，使用十分方便，尤其是便于测定少量液体的pH值。
(A) 玻璃电极 (B) 复合电极 (C) 参比电极（银－氯化银电极）
图1－3 pH
