细胞免疫化学：免疫酶标技术

1）  直接法

1．标本固定。

2．PBS洗涤2×3分钟。

3．1％ H2O2（或1％ H2O2 甲醇）抑制内源性过氧化物，室温10～20分钟。

4．正常血清（1：10）孵育，室温20分钟。

5．滴加酶标记的抗体37℃1小时或4℃过夜。

6．PBS洗涤3×3分钟。

7．DAB＋H2O2显色5～10分钟，镜下控制染色结果。DAB＋H2O2应用前15分钟配制。

8．充分水洗后，复染、脱水、透明、封片、镜检。

2）  间接法

1．标本固定。

2．PBS洗涤2×3分钟。

3．1％H2O2（或1％H2O2 甲醇）抑制内源性过氧化物，室温10～20分钟。

4．正常血清（1：10）孵育，室温20分钟。

5．滴加第一抗体，37℃1小时或4℃过夜。

6．PBS洗涤3×3分钟。

7．滴加酶标二抗，室温1小时。

8．PBS洗涤3×3分钟。

9．0.04％DAB＋0.03 ％H2O2显色5～10分钟。

10．  充分水洗后，复染、脱水、透明、封片、镜检。

3）  PAP法（过氧化物酶抗过氧化物酶抗体复合物法）

1．标定固定后，PBS洗涤。

2．1％H2O2（或1％H2O2 甲醇）阻断内源性过氧化物，室温10～20分钟。

3．PBS洗涤2×3分钟。

4．正常血清（二抗的正常血清）孵育，室温20分钟。

5．滴加一抗，室温1小时或4℃过夜。

6．PBS洗涤3×3分钟。

7．滴加二抗，室温30分钟。

8．PBS洗涤3×3分钟。

9．加PAP复合物，室温60分钟。

10．  PBS洗涤3×3分钟。

11．  0.04％DAB＋0.03％ H2O2显色5～10分钟。

12．  充分水洗。

13．  苏木精复染，封片观察。

4）  双PAP法

1～10同单PAP法。

11．  二次加酶标二抗。

12．  PBS洗。

13．  二次加PAP。

14．  PBS洗。

15．  0.04％DAB＋0.03 ％H2O2显色5～10分钟。

16．  苏木精复染核，封片，镜检。

5）  ABC法（卵白素－生物素－过氧化物酶复合物法）

1～8同PAP法

9）加ABC液，室温60分钟。

10）  PBS洗。

11）  0.04％DAB＋0.03％ H2O2显色5～10分钟。

12）  充分水洗。

13）  苏木精复染核，封片，镜检。