DNA重组技术-连接反应 （一）外源ＤＮＡ和质粒载体的连接反应 外源ＤＮＡ片段和线状质粒载体的连接，也就是在双链ＤＮＡ５''磷酸和相邻的3''羟基之间形成的新的共价链。如质粒载体的两条链都带5''磷酸，可生成４个新的磷酸二酯链。但如果质粒ＤＮＡ已去磷酸...

DNA重组技术-感受态细胞的制备 制备新鲜或冷冻的大肠杆菌感受态细胞 下述操作方案是由Hanahan(1983)提供的，所制备的大肠杆菌DHl、DH5和ＭＭ249感受态细胞培养物能使每微克超螺旋ＤＮＡ以≥5x108转化菌落的频率进行转化，其他大多数大肠杆菌菌株的最高转化率...

RNA的抽提 将器皿浸泡于0.1% DEPC溶液中12小时，70-80℃烘烤干燥，103.4kPa，121℃高压灭菌15分钟，再70-80℃烘烤干燥即可使用。 将超低温保存的组织材料除去样品袋, 放在2层乳胶手套中，迅速用锤子敲成碎块，称重。称取一定量的组织在干烤过的陶瓷碾钵中用...

mRNA的分离纯化 离心管中秤取1克Oligo-dT纤维素，加入1×上样缓冲液 10 ml悬...

cDNA合成 1. cDNA第一链的合成 1.1 取一个0.2 ml 薄壁管，于冰浴上加入： mRNA 模板（100ng/μl） 3 μl SMART寡核苷酸 1 μl CDS/3‘PCR引物 1 μl 混匀，短暂离心收集液滴至管底。 1.2 72°C温育2分钟后，冰浴2分钟并短暂离心收集液滴至管底。 1.3 在管中...

探针的标记和标记产物的纯化 这里介绍三种标记方法：PCR标记、反转录标记、随机引物标记，和两种纯化方法：Microcon 30 filter法和直接沉淀法。 一、PCR标记 1、将2μg待标记的样品DNA加入到一PCR反应管中 2、在冰上，加： 反应缓冲液 5μl 25 mM MgCl2 4μl...

一、问题： RT-PCR 灵敏度：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有 RT-PCR 产物。 可能原因： 1 ． RNA 被降解 建议解决方法： 在用来验证完整性之前先在变性胶上分析 RNA 使用良好的无污染技术分离 RNA ； 在将组织从动物体取出后立刻处理在 100 ％甲酰胺中储存...

一、实验目的 本实验以酵母RNA为材料，将RNA用碱水解成单核苷酸，再用离子交换柱层析进行分离，最后采用紫外吸收法进行鉴定。同时通过测定各单核苷酸的含量，可以计算出酵母RNA的碱基组成。 本实验的目的是： 1. 了解掌握RNA碱水解的原理和方法 2. 掌握离子...

一、实验目的 1. 了解凝胶层析的原理及其应用。 2. 通过测定蛋白质分子量的训练，初步掌握凝胶层析技术。 二、实验原理 凝胶层析又称排阻层析，凝胶过滤，渗透层析或分子筛层析等。它广泛地应用于分离、提纯、浓缩生物大分子及脱盐、去热源等，而测定蛋白质...

Solutions 10X Annealing Buffer 200 mM Tris 8.0 200 ml 1M Tris pH 8.0 10 mM EDTA 8.0 20 ml .5M EDTA pH 8.0 500 mM NaCl 100 ml 5M NaCl 280 ml Q store at room temperature 10X Klenow Buffer 500 mM Tris 7.5 500 ml 1M Tris pH 7.5 100 mM MgCl2 10...