非病毒载体:这类载体的发展较快,目前主要是脂质体,一些具有受体功能的载体也呈现出诱人的前景,关于常见载体的优缺点列于表2。 表23-2 常见基因转运载体的优缺点
(三)靶细胞的选择 理论上讲,无论何种细胞均具有接受外源DNA的能力,目前基因治疗中禁止使用生殖细胞作为靶细胞,而只能使用体细胞,用于转基因的体细胞必须取材方便,含量丰富,容易培养,寿命较长。可选择的细胞有淋巴细胞、造血细胞、上皮细胞、角质细胞、内皮细胞、成纤维细胞、肝细胞、肌肉细胞和肿瘤细胞等。在实际上应用中应具体根据目的条件选择。 (四)细胞转染(tansfection) 将目的基因导入靶细胞的方法很多,大致可分为物理学方法、化学方法、融合法和病毒感染法四类。病毒法已在本节的“基因的转运”中有基因介绍。目前较多使用的是脂质体法。 表23-3 DNA导入哺乳动物细胞常见的方法
在目前的技术状态下,一般而言其基因转染效率很难达到100%。故必须首先将转导细胞和未转导细胞加以区分。这方面的新技术发展很快,常用的转导细胞筛选方法有: 利用基因表达产物筛选法:(1)标记基因筛选法:在载体上引入一个标记基因,或同时导入标记基因,在转染后的适当时间选用合适剂量的选择培养基,筛选标记基因表型,那些已导入外源基因的细胞将存活下来,而未转录的细胞则死于选择性细胞培养基。如在较多的载体中都有neor标记基因存在,若向培养基中加入G418进行选择,最后只有转导细胞存活下来。(2)基因缺陷型受体细胞的选择性:以基因缺陷型细胞作为靶细胞,将正常基因导入基因缺陷型靶细胞后,使用选择性培养基进行筛选。例如将TK基因导入TK-的靶细胞,转录细胞可在HAT培养基中生长,未转导的细胞则不能在HAT培养基中生长。(3)基因共转染技术:将目的基因表达载体DNA和标记基因表达载体DNA混合后共同转移到靶细胞中,分别使用标记基因和目的基因对应的选择剂进行两次筛选,最后得到复合转导的转化子。 分子生物学方法:外源基因是否真的转入靶细胞必须用分子杂交方法进行证实。常用的方法有原位杂效,Southern杂交和打点杂交。其中主要问题是探针的选择。若靶细胞内原来不存在所转入的目的基因,可选用目的基因作为探针;靶细胞内一般无标记基因存在,故标记基因是良好的探针。探针大小可以是较大的DNA片段,亦可是人工合成的DNA单链探针分子。PCR方法目前也已用于转导细胞的鉴定,且该法相对简单易行。 (五)外源基因的表达及检测 在筛选出转化分子后还需要鉴定转导细胞中外源基因的表达状况。其中包括对目的基因和标记基因表达的鉴定。常用方法有原位杂交,Northrn杂交,NRA打点杂交,免疫组织化学染色等,前几项是检测外源基因转录出的mRNA,后者则是检测外源基因翻译出的蛋白质。流式细胞仪是一种较为客观准确的仪器,可定量分析外源基因的表达状况。 一些影响基因表达的因素如表4所示。 表23-4 调节重组细胞表达系统的DNA控制元件
三、基因治病的靶向 基因治疗中的靶向问题是基因治疗中急待解决的问题。逆转录病毒载体是目前治疗中应用较为广泛且效果较好的载体。有关逆转录病毒靶向的研究已取得一些进展,使得基因治疗更为安全和有效。 (一)逆转录病毒转导的细胞类型的选择调节 Mo-HLV是一个可广泛转导多种细胞的病毒,为了使其仅感染某些专一性细胞就必须改变其感染谱。 1、改变Mo-HLV感染谱 按宿主范围可将Mo-HLV分为三类:单向性:只能感染啮齿类细胞;异向性:可感染除啮齿类动物细胞以外的其它的细胞;双向性:可感染人及啮齿类动物等大多数细胞。感染细胞的类型是由病毒的外壳蛋白env确定的。 (1)病毒与抗体的偶联:为了使逆转录病毒定向感染所需要的靶细胞,可将病毒与抗体偶联,该抗体则针对所需感染细胞上特有的抗原。如使单向感染病毒与抗人MHC-1。MHC-II的抗体偶联或与抗人表皮生长因子的抗体偶联后,可以感染人类细胞。Goud等使用此法使单向病毒感染人的肝细胞,可惜病毒未能整合入肝细胞基因组,可能其中还有其它原因。 (责任编辑:泉水) |