第四篇 免疫学的临床应用

第二十章　免疫学检测法

　　免疫学检测技术的用途非常广泛，它们可用于有关免疫疾病的诊断、疗效评价及发病机制的研究。如对传染病、免疫增殖性疾病、免疫缺损病、超敏反应、自身免疫病、移植排斥反应肿瘤的免疫学检测，对诊断、治疗均有很大帮助。此外在医学生物学研究中对抗原性物质或细胞的定性、定量检查不仅推动了对各种免疫学现象的研究，而且扩大免疫学与医学生物许多领域的联系。本章仅介绍常用免疫学检测方法的原理，简要过程和实用意义。

第一节　抗原或抗体的检测

　　一、检测的原理

　　借助抗原和抗体在体外特异结合后出现的各种现象，对样品中的抗原或抗体进行定性、定量、定位的检测。

　　1．抗原与抗体的亲和力(affinity)抗原抗体的结合就像酶与底物的结合，激素与其受体的结合一样不是化学的反应，而是非共价键的可逆的结合。抗原决定簇和抗体分子可变区互补构型，造成两分子间有较强的亲和力。空间构型互补程度不同，抗原和抗体分子之间结合力强弱也不同。互补程度高，则亲和力强。此外，反应温度、酸碱度和离子浓度对抗原和抗体分子上各基因的解离性和电荷特性也有重要的影响，抗体与抗原决定簇之间的结合力大小可用亲合力来表示。高亲合力的抗体与抗原的结合力强，即使抗原浓度很低时也有较多的抗体结合抗原形成免疫复合物。

　　2．抗原或抗体外检测原理根据抗原抗体结合形成免疫复合物的性状与活性特点，对标本中的抗原或抗体进行定性、定位或定量的检测。定性和定位检测比较简单，即用已知的抗体和待检样品混合，经过一段时间，若有免疫复合物形成的现象发生，就说明待检样品中有相应的抗原存在。若无预期的现象发生，则说明样品中无相应的抗原存在。同理也可用已知的抗原检测样品中是否有相应抗体。

　　对抗原或抗体进行定量检测时，以反应中加入抗原和抗体的浓度与形成免疫复物的浓度呈函数关系。

　　（1）根据免疫复合物产生的多少来推算样品中抗原（或抗体）的含量：在一定的反应条件下，加入的已知抗体（或抗原）的浓度一定，反应产生的免疫复合物多少与待检样品中含有相应抗原（或抗体）量成正比。也就是抗体浓度一定时，免疫复合物越多则样品中的抗原量也越多。可用实验性标准曲线推算出样品中抗原（或抗体）的含量。如免疫单向扩散试验、免疫比浊试验和酶联免疫检测等都属于这类方法。

　　（2）抗原或抗体效价滴定的原理：当抗原抗体复合物形成多少不能反应抗原抗体反应强弱时，就不能以检测反应强度来对抗原或抗体进行定量。在实际工作中，把浓度低的反应成分（抗原或抗体）的浓度固定，把浓度高的另一种反应成分作一系列稀释。例如用人血清作抗原免疫3只家兔，比较3只家兔产生抗体的多少，即滴定3只兔血清抗体效价，可用双向琼脂扩散法来滴定，例如将抗体浓度固定，将抗原作不同的稀释度，分别将抗原或抗体滴入琼脂的相应小孔中，观察免疫兔血清与不同稀释度的抗原出现明显沉淀浅的抗原稀释度（如甲兔的抗体效价为1/2000，而丙免的是1/8000则可比较出后者比前者产生抗体的效价要高）。也就是表示效价的稀释度越高，样品中所含待检成分越多。因人血清（抗原）和抗体（免疫兔血清）相比，浓度高，故应稀释抗原。

　　二、抗原或抗体检测的实用意义

　　1．抗体检测的意义检测抗体可用于评价人和动物免疫功能的指标。抗体用于临床治疗或实验研究时也需做纯度分析和定量测定。临床上检测病人的抗病原生物的抗体、抗过敏原的抗体、抗HLA抗原的抗体、血型抗体及各种自身抗体，对有关疾病的诊断有重要意义。

　　2．抗原检测的意义可做为抗原进行检测的物质可分为以下四类：

　　（1）各种微生物及其大分子产物：用于传染病诊断、微生物的分类及鉴定以及对菌苗、疫苗的研究。

　　（2）生物体内各种大分子物质：包括各种血清蛋白（如各类免疫球蛋白、补体的各种成分）、可溶性血型物质、多肽类激素、细胞因子及癌胚抗原等均可做为抗原进行检测。在对这些成分的生物学作用的研究以及各种疾病的诊断有重要意义。

　　（3）人和动物细胞的表面分子：包括细胞表面各种分化抗原（如CD抗原）、同种异型抗原（血型抗原或MHC抗原）、病毒相关抗原和肿瘤相关性情抗原等。检测这些抗原对各种细胞的分类、分化过程及功能研究、对各种与免疫有关的疾病的诊断及发病机制的研究，均有重要意义。

　　（4）各种半抗原物质：某些药物、激素和炎症介质等属于小分子的半抗原，可以分别将它们偶联到大分子的载体上，组成人工结合的完全抗原。用其免疫动物，制备出各种半抗原的抗体，应用于各种半抗原物质的检测，例如对某些病人在服用药物后进行血中药物浓度的监测。对运动员进行服用违禁药品的检测，都是应用半抗原检测的方法。

　　三、抗原或抗体检测的方法

　　由于各种检测方法中所用的抗原性状不同，出现结果的现象也不同。最广泛应用方法有下述几种：

　　（一）沉淀反应

　　可溶性抗原与抗体结合，在两者比例合适时，可形成较大的不溶性免疫复合物。在反应体系中出现不透明的沉淀物，这种抗原抗体反应称为沉淀反应（precipitation neaction）。

　　1．环状沉淀试验　　先将含抗体的未稀释的免疫血清加到直径小于0.5cm的小试管底部。将稀释的含有可溶性抗原的材料重叠于上，让抗原与抗体在两液体的界面相遇，形成白色免疫复合物沉淀环，故名为环状沉淀试验（ring precipitationtest）,此法简便易行，需用材料较多是其缺点。

　　2．单向免疫扩散试验　　单向免疫扩散试验（single immunodiffusion）是在凝胶中进行的沉淀反应。将抗体混入加热溶解的琼脂中，倾注于玻片上，制成含有抗体的琼脂板，在适当位置打孔，将抗原材料加入琼脂板的小孔内，让抗原从小孔向四周的琼脂中扩散，与琼脂中的抗体相遇形成免疫复合物。当复合物体积增加到一定程度时停止扩散，出现以小孔为中心的圆形沉淀圈，沉淀圈的直径与加入的抗原浓度成正相关。本方法简便，易于观察结果，可测定抗原的灵敏度（最低浓度）约为10～20μg/ml，常用于定量测定人或动物血清IgG、IgM、IgA和C3等，其缺点是需1～2天才能看结果（图20-1）

图20-1 单向免疫扩散试验示意图

　　3．免疫比浊法　 当抗体浓度高，加入少量可溶性抗原，即可形成一些肉眼看不见的小免疫复合物，它可使通过液体的光束发生散射，随着加入抗原增多，形成的免疫复合物也增多，光散射现象也相应加强。免疫比浊法（immunonephelomytry）就是在一定的抗体浓度下，加入一定体积的样品，经过一段时间，用光散射浊度计（nephelometry）测量反应液体的浊度，来推算样品中的抗原含量。本法敏感、快速简便，可取代单向扩散法定量测定免疫球蛋白的浓度。

　　4，双向免疫扩散试验　 双免疫扩散试验（double immunodiffusion）是在琼脂板上按一定距离打数个小孔，在相邻的两孔内分别放入抗原和抗体材料。当抗原和抗体向四周凝胶中扩散，在两孔间可出现2～3条沉淀线，本法常用于抗原或抗体的定性或定量检测，或用于两种抗原材料的抗原相关性分析（图20-2）。

图20-2 双向免疫扩散试验示意图

　　5．对流免疫电泳　对流电泳（counterimmunoelectrophoresis）是一敏感快速的检测方法，即在电场作用下的双向免疫扩散。将琼脂板放入电泳槽内，使琼脂板的两孔沿着电场的方向，于负极侧的孔内加入抗原，于正极侧的孔内加入抗体，通电后，抗原带负电荷向正极泳动，抗体分子虽也带负电荷，但因分子量大，向正极的位移小，而受琼脂中电渗作用向负极移动，抗原和抗体能较快地集中在两孔之间的琼脂中形成免疫复合物的沉淀线。只需1小时左右即可观察结果。

　　6．免疫电泳　 免疫电泳(immunoelectrophoresis)的方法分成两个步骤，即先进行电泳，再进行琼脂扩散。先将样品加入琼脂中电泳，将抗原各成分依电泳速度不同而分散开。然后在适当的位置上沿电泳方向挖一直线形槽，于槽内加入含有针对各种抗原混合抗体液，让各抗原成分与相应抗体进行双向免疫扩散，可形成多答卷沉淀线。常用此法进行血清的蛋白种类分析。对于免疫球蛋白缺损或增多的疾病的诊断或鉴别诊断有重要意义（图20-3）。

图20-3 免疫电泳法基本步示决图

　　7．免疫印迹法免疫印迹法（immunoblotting）又称为Western印迹法，用于AIDS的血清抗体检测。第一步，为电泳分离HIV抗原，在电场中根据分子量大小不同病毒抗原各成分散开。第二步，将电泳分离的蛋白质转移到硝酸纤维膜上（电印迹），然后将印迹有病毒抗原的硝酸纤维膜浸湿于病人血清中。如果病人血清中含有与一种或几种抗原相对应的抗体的话，则在该抗原印迹部位形成免疫复合物沉淀。在洗去未沉淀的抗原和抗体后，在膜上加标记的抗人免疫球蛋白的抗体，此抗体可以和病毒抗原与人抗体形成的免疫复合物发生反应，最后加入显色底物（如果抗人Ig是用酶标记的）或做放射自显影（抗人Ig用125Ⅰ标记）以显示结果（图20-4）。

图20-4 用免疫印迹法检查患者血清中的HIV病毒抗体

第一步：经电泳将HIV混合抗合抗原按分子量大小分离；

第二步：将已分离的抗原经电印迹转移到硝酸纤维膜上；

第三步：将待检病人血清加入覆盖于硝酸纤维膜上；

第四步：加入标记的第二抗体使之覆盖膜上；

第五步：加入显色底物（或放射自显影）显现第二抗体

　　（二）凝集反应

　　细菌、红细胞或表面带有抗原的乳胶颗粒等都是不溶性的颗粒抗原，当与相应抗体结合，抗原与抗体结合形成凝集团块，即称为凝集反应（agglutination）。

　　1．直接凝集 　直接凝集（direct agglutination）是将细菌或红细胞与相应抗体结合产生的细菌凝集或红细胞凝集现象。可用于传染病诊断如肥达氏反应（Widal reaction）诊断伤寒病。或利用血细胞凝集现象检查血型。

　　2．间接凝集 　间接凝集（indirect agglutination）是用可溶性抗原包被在乳胶颗粒或红细胞表面，与相应抗体混合出现的凝集现象。如用γ球蛋白包乳胶颗粒检测类风湿关节炎病人血清中的类风湿因子，用甲状腺球蛋白包被乳胶颗粒用于检测甲状腺球蛋的抗体。也可以将抗体吸附到乳胶颗粒上检查临床标本中的抗原，如细菌或真菌性脑膜炎抗体包被的乳颗粒，一旦与含有相应抗原的脑脊液混合，便可发生凝集，可进行快速诊断。故凝集反应即可测定抗原，也可测抗体，方法简便、敏感。