最常用的支持物是Separose4B，将此支持物与溴化氰在pH11时进行处理，则能使支持物活化。此时溴化氰与支持物上的羟式反应形成氨基甲酸酯基团。加入溴化氰的量取决于支持物的量。如果希望取代程度提高，则加入溴化氰的量也要提高。交联时首先要注意加入抗原或抗体的浓度。通常在交联反应混合物中的交联蛋白质浓度应是亲和分离浓度的20～30倍。这样，溴化氰浓度也必须提高到200mg/ml凝胶。若希望最终产物含量较少，所加入的溴化氰也应减少。交联时的pH也应注意，pH9.5～10时，活化的琼脂糖珠很不稳定。降低pH，也就减少了能反应的配体浓度，交联量就会减少。

　　亲和层析中常用小分子抗原或其它化合物与支持物交联，由于载体空间的位阻而影响了与抗原或其它亲和物的结合，产生了所谓的无效吸附。另外，Sepharose4B交联时要求有一游离的氨基，如果该抗原有具氨基则难于交联。基于这两个原因，通常在琼脂糖与抗原之间接上不同长度的“手臂”。必要时这些“手臂”末端可接上游离氨基，以与不带氨基的配基偶联。常用的带“手臂”琼脂糖有氨基琼脂糖（二亚胺）、羧基琼脂糖（琥珀酸酐）、溴乙酰琼脂糖（0-溴乙酰-N－羧基琥珀酰胺）、重氮盐衍生物琼脂糖和疏基琼脂糖等。这些带“手臂”的琼脂糖有商品供应，使用极为方便。

　　4．亲和层析条件的选择

　　（1）支持物与抗原或抗体结合后，还可能有多余的活性基团，为了封闭这些残基团，必须用无关蛋白质或三乙醇胺过一次柱，以封闭活性基团。

　　（2）去掉未结合及结合不牢固的蛋白质。先用0.2mol/LNaHCO₂（含0.1mol/LNaC1，pH9.0）洗脱2～3个柱体积，再用解脱剂处理一次亲和层析柱。

　　（3）解脱剂有多种。常用的有0.2mol/LpH2.8甘氨酸－HC1缓冲液、0.1mol/LpH2.4甘氨酸缓冲液、7mol/L脲、5mol/LNaI、3mol/L硫氰酸钾（或钠）、1mol/L乙酸、6mol/L盐酸胍、0.2mol/LKC1等。作为抗原抗体解脱剂，最多用的是3mol/L硫氰酸钾（或钠）及0.1mol/LpH2.4甘氨酸缓冲液。

　　（六）免疫球蛋白片段的制备

　　免疫球蛋白具有抗原性，可用以免疫动物制备相应的抗体，而这种抗体常用于免疫球蛋白的检测。五类免疫球蛋白皆可用前面介绍的纯化方法提取出来。如将这些免疫球蛋白分解成片段，如Fc段、Fab段、轻链等作为免疫原制备抗血清，则可制得分辨能力更高的特异性抗体。制备方法如下：

　　1．温和条件析离亚单位亚单位之间以非共价键、如氢键、静电引力等连接起来，这些键结合力较弱，可经2种方法将其断开制备片段。第一种方法是改变pH，一般将pH调至3～4（羧基滴定范围）和9～10（赖氨酸－酪氨酸滴定范围），当低于3或高于10时，亚单位会离解。这个方法是利用强变性剂，如8mol/L盐酸胍等。用此可以将亚单位分开。这个方法也用于载脂蛋白抗原的解离和胶原肽的提取。

　　2．二硫键的解离二硫键是连接Ig肽链的共价键，解离二硫键可将轻链与重链分开。解离的方法多采用氧化法和还原法。氧化法的优点是切开后，肽链不能重新形成二硫键，便于肽链纯化；缺点是甲硫氨酸被氧化成亚砜，色氨酸侧链被破坏。还原法是将二硫键还原成巯基。但这个疏基极不稳定，易再重新结合成二硫键，必须及时用碘乙酸或碘代乙酰胺进行羧甲基化。

　　3．溴化氰裂解法溴化氰与蛋白质中的甲硫氨酸侧链的硫醚基起反应，生成溴化亚氨内酯。此产物与水反应，将肽链断裂。

　　4．酶裂解法因为酶解有极好的专一性，不同的片段可用不同的酶裂解。如木瓜酶可将IgG裂解成Fc和Fab（×2）3个片段，胃蛋白酶可将IgG解成F(ab＇)₂和几个小肽段，胰蛋白酶则将其切成不规则的肽链。作为抗原制备常用木瓜酶切断，取得Fc段，以制备抗链血清。作为抗体试剂应用，常用胃蛋白酶切断取得F(ab＇)₂。

　　（七）纯化抗原的鉴定

　　纯化抗原的鉴定方法较多，常用的有聚丙烯酰胺凝胶电泳法、结晶法、免疫电泳法、免疫双扩散法等。事实上，仅用一种方法还无法作纯度鉴定，只有几种方法联合应用才较可靠。结晶法不是纯度的标准，因结晶中往往含有其它成分。电泳谱中呈现单一区带也不能排除在这条带中含有其他成分。有时虽出现几条带，也可能是同一物质的聚合体或降解物。

　　蛋白抗原的定量可用生化分析中的常用方法。根据测试抗原量的多少可用双缩脲法或酚试剂法。如果抗原极为宝贵，可用紫外光吸收法。

　　三、半抗原免疫原的制备

　　多肽、甾族激素、药物、脂肪胺、核苷等小分子物质仅能与相应的抗体发生特异性结合反应，而它们自己并不是免疫原，不能诱导抗体产生。只有将这种半抗原与蛋白质或其他高聚物结合后才能刺激机体产生抗体。结合的方法有物理法和化学法。物理吸附的载体有淀粉、聚乙烯吡咯烷酮（PVP），硫酸葡聚糖、羧甲基纤维素等，是通过电荷和微孔吸附半抗原。化学法是利用功能团把半抗原以载体上。

　　（一）载体选择

　　1．蛋白质类蛋白质是结构复杂的大分子胶体物质，是一种良好的载体。常用的有人血清白蛋白、牛血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白和血蓝蛋白等。其中以牛血清蛋白最为常用，因其溶解度大，免疫活性强，又容易获得。蛋白质和半抗原结合是通过游离氧基、游离羧基、酚基、巯基、咪唑基、吲哚基和胍基等活性基团的缩合。

　　2．多肽类聚合物是人工合成的多肽聚合物，常用的是多聚赖氨酸（polylysine）。这种多聚合物与半抗原结合后，可诱发动物产生高滴度、高亲和力的抗体。多聚赖氨酸的分子量可达十几万到几十万，是良好的载体。

　　3．大分子聚合物和某些颗粒PVP、羧甲基纤维素和活性碳等皆可与半抗原结合，加入福氏完全佐剂可诱发产生良好的抗体。

　　因半抗原种类、动物类别、载体种类及结合方法的不同，制得的免疫原对动物免疫所产生的效果也不同。实际应用时，应多采用几种载体或方法。

　　（二）连接方法

　　半抗原与载体连接要掌握3个基本条件：带游离氨基或游离羧基以及二种基团皆有的半抗原，如多肽激素类（脑啡肽、胃泌素、ACTH、前列腺素等），它们有游离的氨基或羧基。羧基可用混合酸酐法和碳化二亚胺法与载体氨基形成稳定的肽键。同样，带氨基的半抗原则可与载体羧基缩合。亦可用双功能试剂如戊二醛、甲苯2，4-二异酸盐与载体氨基连接。脂肪胺可用碳化二亚胺缩合剂或对硝基苯酰氯反应，把脂肪胺变为对硝基苯酰胺，通过加氢还原为氨基苯酰衍生物，再用重氮化反应。②带有羟基、酮基、醛基的半抗原，如醇、酚、糖、多糖、核苷以及甾族激素等，它们都不能直接与载体连接，需要用化学方法在半抗原上引起羧基后才能与载体连接。③芳香族半抗原由于环上带有羧基，它邻位上的氢很活泼，极易取代。

　　半抗原和载体连接的方法在一般实验室皆可完成，但反应条件应严格要求，以防半抗原失活或载体严重变性（一般变性并不妨碍）。

　　1．碳化二亚胺法碳化二亚胺是一种化学性质非常活泼的双功能试剂，常用的水溶性碳化二亚胺化学名为1-乙基-3-（3-二甲氨基）-碳化二亚胺盐酸盐。它可与半抗原的羧基、也可与其氨基结合，反应如下：+

　　此连接方法十分简便，只需将载体蛋白质和抗原按一定比例混合在适当的溶液中，然后加入水溶性碳化二亚胺，搅拌1～2h，置室温24h，再经透析即可。

　　2．戊二醛法戊二醛也是常用的双功能交联剂，它借两端的醛基与载体和半抗原的氨基以共价键连接，其反应如下：

　　蛋白质-NH₂+半抗原-NH₂+COH-(CH₂)₃-COH→蛋白质-N=CH-(CH₂)₃-CH=N-半抗原

　　3．氯甲酸异丁酯法该法又称为混合酸酐法，是利用半抗原上的羧基和载体蛋白上的氨基以肽链相连接，方法简便，多用于类固醇抗原的制备，其反应如下：

　　（三）无羧基和氨基半抗原衍生物的制备

　　某些类固醇和药物，需加以适当的改造，使其转变为带有羧基或氨基的衍生物。依据半抗原的性质有如下4种方法。

　　1．琥珀酸酐法琥珀酸酐是琥珀酸的脱水产物，遇水又可恢复。如果将带有羟基的半抗原化合物和琥珀酸酐在无水的吡淀中反应，就可得到带有羧基的半抗原琥珀酸的衍生物。再经碳化二亚胺可氯甲酸异丁酯法，制备载体半抗原。制备衍生物的反应如下：

　　2．O-（羧甲基）羧胺法带有酮基的半抗原与O-（羧甲基）羟反应，转变为带有羧基的半抗原衍生物。反应式如下：

　　半抗原-C=O+H₂N-O-CH₂COOH→半抗原-C=N=O=CH₂-COOH

　　3．一氯醋钠法带有酚基的半抗原，可用一氯醋酸钠法，生成带有羧基的半抗原衍生物。其反应式如下：

　　4．重氮的对氨基苯甲酸法先将对氨基苯甲酸和亚硝酸钠反应，反应产生再作用于带有酚基的半抗原，获得带有羧基的半抗原衍生物。反应式如下：

　　四、佐剂

　　为了促进抗体产生，可在注射抗原的同时，加入一种辅助剂，这种辅助剂称为佐剂。佐剂本身可以有免疫原性，也可不具备免疫原性。常用的有免疫原性的佐剂有百日咳杆菌、革兰阴性杆菌的内毒素和抗酸杆菌（包括结核分枝杆菌和枯草分枝杆菌）等；非抗原性的佐剂有铝乳、磷酸钙、石蜡油、羊毛脂、表面活性剂、藻酸钙、聚核苷酸、胞壁肽等。应用最多的是福氏（Freund）佐剂，是用石蜡油、羊毛脂和卡介苗混合而成。

　　佐剂的作用机制极为复杂。在佐剂－抗原的注射部位，可见到细胞浸润，几天后，局部形成肉芽肿（细胞免疫反应）。起初，反应部位以肉芽组织为主，以后则见多量巨噬细胞、浆细胞、巨细胞、类上皮细胞。局部淋巴结和脾中也可见大量浆细胞，提示佐剂可以直接刺激参与免疫反应的细胞并使之增生。有许多佐剂如内毒素、分枝杆菌、小棒状杆菌、聚核苷酸、皂素等对细胞膜有活化作用，它们可增加巨噬细胞和淋巴细胞的细胞通透性，促进了对抗原的有效处理。佐剂一般是乳剂或悬液，当与水溶液抗原混合后形成一种油包水或水包油的乳状颗粒，这种颗粒延缓了抗原的吸引，增加了局部刺激作用。

　　另有报告，佐剂和抗原混在一起注射可以改变抗原的分布。应用核素标记的合成多肽或沙门氏菌鞭毛抗原与福氏佐剂混合注入大鼠或豚鼠后肢足掌，测定局部引流淋巴结、脾和血清中的抗原含量，发现它可明显地延长抗原从局部吸收的时间。对于低分子量的多肽，这一作用较为短暂，而对于鞭毛抗原，这一作用十分明显。虽然吸收被延缓，但在淋巴结和脾中，抗原的含量都明显高于不用佐剂的动物。这提示，抗原与佐剂同时应用，可促进抗原在淋巴组织中存留。

　　福氏佐剂分为不完全佐剂（石蜡油＋羊毛脂）和完全佐剂（石蜡油＋羊毛脂＋卡介苗）。佐剂和抗原的比例为1:1。由于佐剂是油剂，加入抗原后要充分混合成乳剂。混合的方法有2种，一为研磨法，二为搅拌混合法。研磨法用一乳钵（玻璃或玛瑙），先将佐剂加热倾入，待冷却后加入卡介苗（2～20mg/ml），再逐滴加入抗原，边滴边加速研磨，直至完全变为乳剂为止。另一种方法是用两个5ml注射器，在接针头处用一尼龙管连通，一个注射器内是佐剂，另一注射器内为抗原。装好后来回推注，经多次混合逐渐变为乳剂。本法优点是无菌操作，节省抗原或估剂，用此注射器可直接注射；缺点是不易乳化完全。乳化完全与否的鉴定方法是将一滴乳剂滴入水中，如立即散开，则未乳化好，如不散开漂在水面则为乳化完全。