microRNA（miRNA）是一类内源性、短的非编码单链RNA（18-23个核苷酸），通过转录后抑制信使RNA（mRNA）参与细胞增殖、分化和凋亡等生物学过程。miRNA的失调与癌症等多种疾病密切相关。在基于液体活检的癌症诊断、预后和监测中，循环miRNA的检测具有巨大潜力。然而，由于miRNA长度短、家族内序列相似性高、在不同细胞类型和生物体液中浓度范围大，以及其起源和载体的多样性，高性能检测面临挑战。因此，开发超灵敏、特异且稳健的生物测定和传感器，对于推动临床可行的疾病miRNA生物标志物开发至关重要。
逆转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）是检测miRNA的金标准。与长RNA（如mRNA）不同，短miRNA需要特殊的逆转录过程以引入扩展序列，便于PCR扩增和检测。此外，多种等温扩增方法已被开发用于miRNA检测，包括滚环扩增（RCA）、指数扩增反应（EXPAR）、环介导等温扩增（LAMP）、杂交链反应和催化发夹组装。这些方法虽具有操作简单甚至无需仪器的优点，但也存在局限性，如EXPAR和LAMP的非特异性扩增和高背景信号，以及杂交链反应和催化发夹组装的动力学慢、灵敏度低。其他标准技术如微阵列、NanoString和测序，则需要复杂仪器或工作流程、高操作成本和有限的分析性能，阻碍了其在临床诊断中的广泛应用。
近日，美国研究团队在《自然·生物医学工程》（Nature Biomedical Engineering）上发表题为“A one-pot isothermal Cas12-based assay for the sensitive detection of microRNAs”的文章。他们报道了一种一步、一锅等温CRISPR-Cas12a检测方法（EXTRA-CRISPR），用于快速特异性检测miRNA，灵敏度与RT-PCR相当。研究团队将EXTRA-CRISPR用于量化细胞外囊泡（EV）中的miRNA生物标志物（miR-21、miR-196a、miR-451a和miR-1246），以进行胰腺导管腺癌（PDAC）的液体活检诊断，并通过平行RT-qPCR分析验证了其分析和诊断性能。结果表明，该技术有望推动miRNA检测及其生物标志物的临床开发，用于基于液体活检的癌症诊断和预后。
EXTRA-CRISPR测定原理
EXTRA-CRISPR检测设计为三酶级联反应，利用CRISPR-Cas12a系统的顺式和反式切割活性，将线性RCA转化为指数扩增。Cas12a核糖核蛋白（RNP）通过顺式活性结合并切割RCA产生的长单链DNA扩增子，生成含有靶序列的二级引物，启动后续RCA循环，实现靶标的指数扩增。同时，扩增子激活的Cas12a RNP非特异性切割单链DNA报告子，产生并放大荧光信号。
EXTRA-CRISPR测定优化与表征
作者优化了锁式探针结构、连接酶、变性退火步骤、RCA缓冲液添加剂、聚合酶浓度以及CRISPR组分（RNP和报告子）浓度。优化后的EXTRA-CRISPR分析性能通过金标准RT-qPCR平行测量得到验证。与商业miRCURY LNA miRNA PCR试剂盒相比，EXTRA-CRISPR一锅法检测灵敏度相当，3小时流程的检测限（LOD）为1.57 fM。
特异性评估中，检测了多个非靶miRNA，包括在锁式探针连接位点具有单核苷酸错配的合成miR-21和8个1 pM的人miRNA。这些测试产生的信号水平约为miR-21信号的2%或更低，显示出优异特异性。对于连接位点偏移三个核苷酸的单个错配，非特异性信号水平约为25%。结果表明，一锅EXTRA-CRISPR测定法使用适当设计的锁式探针，能以飞摩尔灵敏度和单碱基特异性快速检测miRNA。
EV-miRNA定量分析
作者采用EXTRA-CRISPR检测用于诊断PDAC的小EV（sEV）miRNA。从细胞培养基和人血浆样本中分离sEV并提取短RNA，使用一锅EXTRA-CRISPR和两步RT-PCR进行平行测量。检测的miRNA包括miR-21、miR-196a、miR-451a和miR-1246。EXTRA-CRISPR检测三种miRNA的校准图显示，miR-196a的LOD为1.35 fM（线性范围5–500 fM），miR-451a为4.14 fM（5–500 fM），miR-1246为7.96 fM（20–500 fM），与标准RT-qPCR相当。EXTRA-CRISPR还显示出对四个靶标的高度特异性，交叉反应性最小。
EV-miRNA在胰腺癌诊断中的应用
研究评估了EXTRA-CRISPR在无癌对照组（n=15）和PDAC患者（n=20）血浆样本中的表现。测量EV miRNA（miR-21、miR-196a、miR-451a和miR-1246）水平，PDAC队列中表达升高。与单个标志物相比，EV Sig（miR-21、miR-451a和miR-1246的加权线性组合）提高了区分PDAC组和健康组的能力，AUC值从miR-196a的0.677到miR-451a的0.793，EV-Sig小组的AUC为0.853。
智能手机型EXTRA-CRISPR用于POC测试
为测试即时检测（POC）应用，作者构建了低成本、便携式智能手机EXTRA-CRISPR检测系统，由3D打印部件、蓝色LED管、光学滤波器和加热板组成。智能手机获取荧光图像并分析强度。与商业qPCR热循环仪比较，POC原型能检测四名对照和四名PDAC患者血浆sEV中的标志物，并区分两组，结果与qPCR一致。
EXTRA-CRISPR-LFA分析
EXTRA-CRISPR也可与侧流分析（LFA）结合（EXTRA-CRISPR-LFA）。结果显示，随着靶浓度增加，测试线强度增加。与荧光检测相比，LFA定量性能下降，LOD为100 fM，检测范围<2-log，但仍优于现有LOD在皮摩尔水平的LFA方法。使用相同患者样本测试，sEV miR-451a的LFA检测产生最高视觉信号和最佳诊断性能。两种POC模式的原理验证研究表明，EXTRA-CRISPR技术有潜力成为开发低成本POC诊断测试的适应性工具。
总结与讨论
EXTRA-CRISPR具有灵敏、特异、易操作、快速和低成本的特点，为临床样本miRNA分析提供了标准RT-qPCR的替代方案。该方法简单性将促进仪器或微流控的小型化和集成，实现全自动化，提高通量和重现性，减少样品消耗和周转时间。
EXTRA-CRISPR与现有基于CRISPR的生物传感方法有三个主要区别：首先，同时利用Cas12a的顺式和反式切割活性；其次，通过模块化锁式探针设计和反应动力学，将靶介导的连接、RCA、Cas12a结合和核酸切割整合为一步单管等温分析；第三，一锅等温miRNA检测提供与RT-qPCR相当的分析性能，包括飞摩尔检测限、单核苷酸特异性和快速灵活周转。一锅EXTRA-CRISPR技术简化了工作流程，消除了对专用仪器的需求，为POC诊断提供了适应性强的模式。
本文转载自“小桔灯网”