（3）DNaseⅠ:干粉状DNaseⅠ(2000～3000u/mg)溶于20mmol/l Tris-HCl, pH7.5中（1mg/ml）,10μl分装，-20℃保存一年。

　　（4）10×DNA聚合酶Ⅰ（Klenow片段）缓冲液：500mmol/l Tris-HCl,pH6.6;100mmol/L Mg－Cl₂;10mmol/L DTT;0.5mg BSA。

　　（5）10×激酶缓冲液：500mmol/L Tris-HCl,pH7.4,50mmol/L MgCl₂;20mmol/L DTT; 1.0mmol/L亚精胺。

　　（6）10×随机引物标记缓冲液；500mmol/l Tris-HCl,pH6.6;100mmol/L MgCl₂;10mmol/L β-巯基乙醇；500μg/ml BSA。

　　（7）1×加尾缓冲液：100mmol/L二甲胂化钾，pH7.0,1mmol/l CoCl₂ 0.2mmol/L DTT。

　　（8）1mol/L MgCl₂:MgCl₂ 47.60g溶于500ml水中，100ml分装，高压灭菌，室温保存。

　　（9）0.25mol/L EDTA(Ph8.0):EDTA 52.02g溶于400ml水中，调pH至8.0，加水至500ml，100ml分装，高压灭菌，室温保存。

　　（10）4mol/L醋酸钠：取无水醋酸钠82g溶于200ml水中，用醋酸调pH至6.5，加水至250ml，高压灭菌，或0.45μm膜过滤，室温保存。

　　（11）10% SDS：10g SDS（十二烷基硫酸钠）溶于50ml水中，加水至100ml，分装后室温保存。

　　（12）20×SSC：取NaCl 175.3g;柠檬酸钠88.2g;加水至1000ml，用10mol/l NaOH调pH至7.0；高压灭菌，室温保存。

　　（13）无菌水：100ml去离子水或双蒸水，分装，高压灭菌，室温保存，开瓶后仅限一周使用。

　　（14）10×激酶缓冲液：500mmol/L Tris-HCl,pH7.4;100mmol/L MgCl₂;50mmol/l DTT;10mmol/L亚精胺（非必需）。

　　（15）T₄多聚核苷酸激酶：10u/μl，保存在甘油中，-20℃。

　　（16）TE缓冲液（Tris/EDTA）：Tris,10mmol/l pH7.4(0.5ml 2mol/L贮存液)，1.0mmol/l ED－TA,pH8.0(20μl 0.5mol/L)贮存液，加水至100ml，室温保存。

　　（17）2mol/L Tris-HCl pH7.4:Tris242.2g溶于850ml，加浓HCl 75ml ,边加边缓慢搅动，至pH7.4,于加水至1000ml。

　　（18）1mol/L DTT(二硫苏糖醇)：3.0g DTT溶于20ml水中，分装，于-20℃贮存。

　　（19）0.5mol/L EDTA（乙二胺四乙酸二钠盐）：在烧杯中先加入300ml水，加入93.5g EDTA－Na₂·2H₂O,充分混匀，加10mol/l NaOH调pH至8.0,加水至500ml。

　　（20）10mol/L NaOH：200g NaOH溶于450ml水中，混匀，再加水至500ml。

　　（21）5mol/L NaCl：292.25g NaCl,加水至1000ml。

　　（22）1mol/L HCl：加86.2ml浓盐酸至913.8ml水中。

　　（23）1mol/L CaCl₂：147g CaCl₂：2H₂O,溶于1000ml水中,高压灭菌,室温保存。

　　三、固定剂

　　进行原位杂交的组织或细胞标本常需经固定处理。尽管许多化学物质对组织/细胞有固定作用，但核酸原位杂交的理想固定液应具备如下特点：①能很好地保持组织细胞的状态；②对核酸无抽提、修饰及降解作用；③不改变被检核酸分子在组织细胞内的定位；④对核酸及探针的杂交过程无阻碍作用；⑤固定液本身对杂交信号无遮蔽、掩盖作用，如不使本底增加等；⑥理化性质稳定、价格低廉。

　　1．4%多聚甲醛（Paraformaldehyde,PFA）

　　配法：称取40g PFA溶于装有500ml DEPC水的玻璃容器（烧杯或烧瓶）中，持续加热磁力搅拌至60～65℃，使成乳白色悬液。用1.0mol/L的NaOH值至7.0，使呈清亮状（滴加），再加入约500ml 2×PBS^※，充分混匀（在冰浴或冷水浴中），可再检测一下pH，过滤后定容至1000ml，室温或4℃保存备用。

　　注意：①配制时应在通风条件下操作，并避免接触皮肤和吸入（戴手套及口罩），因PFA有较强的固定作用及毒性，对粘膜及皮肤有固定及毒性，刺激作用；②加热时，温度不宜过高，常为60～65℃，否则，PFA降解失效；③配制好的PFA虽可存放一定时间，但过久的液体，固定效果下降，建议尽早使用。

　　附：固定液用PBS的配制：

　　配法：按上述比例称取试剂，溶于DEPC水（也可用蒸馏水加DEPC）500～800ml中，过滤后，加水定容至1000ml，高压灭菌。通常配制成10×PBS的储备液，2×PBS和1×PBS可用DEPC水稀释获得。

　　除用DEPC水配制PFA外，也有用灭菌蒸馏水或经DEPC处理的0.01～0.1mol/L的PBS配制的，方法及注意事项同上。

　　4% PFA是目前原位杂交组织化学技术中最常用的固定液，它能较好地保持组织及细胞内的RNA，同时对形态保持也较好。通常组织块固定4～12h，载片固定时间在10～15min以内，RNA含量较为恒定。过度延长固定时间会引起细胞内生物大分子的过度交联，影响探针的穿透力，降低杂交效率。

　　2．甲醛

　　①10%甲醛（Formaldehyde,FA）

　　量取二者充分混合而可。较适于检测RNA的组织及细胞固定，也可用于新鲜冰片切片后固定。

　　②10%福尔马林试剂：

　　较适于固定细胞。

　　③10%中性福尔马林

　　市售甲醛　　　　　　　　　　　100ml

　　Na₂HPO₄4g

　　NaH₂PO₄6.5g

　　DEPC水　　　　　　　　　　　～1000ml

　　常用于石蜡样品切片的固定。

　　10%的甲醛由于有促进DNA双链分子交联的作用，干扰DNA变性，故不适于DNA杂交。在组织或细胞原位杂交中，可通过使用含50%甲酰胺的杂交液使DNA变性解链而解决。这类固定液在DNA/RNA杂交中有较好的效果。

　　3．4%戊二醛效果较40%差。

　　4．0.1%戊二醛常用于固定组织，适于新鲜组织冰冻切片及石蜡切片的后固定，常用于检测DNA的原位组织杂交方法。

　　5．乙醇/醋酸（或冰醋酸）将乙醇与醋酸按3：1的体积比充分混合即可。该液较适于固定细胞的原位杂交，尤其检测DNA时。

　　乙醇/醋酸虽广泛应用于原位杂交中，但RNA保留较差，可本底很低，即背景染色淡。

　　6．甲醇/醋酸（3：1）用前按体积比3：1比例充分混合即可。

　　7．甲醇/丙酮（1：1）适于培养细胞的原位杂交技术。

　　8．4%多聚甲醇-0.5%～1%戊二醛溶液在pH7.4磷酸缓冲液中，用于免疫电镜样品固定。

　　四、LB培养基

　　（一）液体LB培养基（Luria-Bertani培养基）

　　配制：取一1000ml的烧杯，将事先称取好的试剂加入杯内，加H₂O约500～800ml搅拌使其溶解完全。用5N的NaOH调pH至7.0,加入H₂O定容至1000ml。15磅高压灭20min。

　　（二）琼脂糖平板培养基　

　　细菌培养用琼脂（或琼脂糖）　　　　15g

　　液体培养基（如LB）　　　　　　　　～1000ml

　　按浓度比例，将琼脂加入液体培养基（如LB）中，稍加搅拌，用纱布或纸封好瓶口，15磅高压灭菌20min。

　　五、小量质粒提取主要液体

　　1．溶液Ⅰ

　　2．溶液Ⅱ

　　3．溶液Ⅲ（3mol/L醋酸钠）

　　加热溶解后，再用冰醋酸（约40ml）调pH至4.8，补足H₂O至200ml。

　　六、杂交前处理

　　1．蛋白酶（Proteinawe K, Pro.K） 蛋白酶K主要用于杂交前标本处理，其作用是使组织达到一定消化，利于检测分子的穿透，从而提高检测方法的敏感性，但各种组织在不同条件下消化程度不一，因此，具体应用时，应根据组织种类、温度确定反应时间及酶的浓度。过度消化可使组织形态结构遭到明显破坏，核酸分子也会受到影响。通常是将其配成储备液（1mg/ml），临用前，再配成工作液（约0.025mg/ml）。配制方法：

　　精心称药，将二者充分混合后，分装成小份，-20℃存放，用时再取出冻融，余者弃去。

　　（2）工作液（临用前配）：

　　取储备液（1mg/ml）按1：40稀释，充分混合，即得约含Pro.K为25mg/ml的工作液。

　　（3）关于P-K缓冲液的配制：

　　称取上述试剂，充分混合即可。

　　②1mol/L 的Tris-HCl(pH8.0)：

　　先将Tris于800ml ddH₂O中溶解，用HCl将pH调至8.0,ddH₂O定溶于1000ml，高压灭菌，室温备用即可。

　　③0.5mol/L的EDTA：

　　称取EDTA溶于约600ml ddH₂O中，常需60℃持续搅拌以助溶，滴加NaOH至pH接近8.0时，EDTA才开始溶解。待完全溶解后，冷却至室温，NaOH调pH至8.0,ddH₂O定溶至1000ml，高压灭菌，室温备用。

　　2．甘氨酸

　　（1）1mol/L甘氨酸：

　　称取甘氨酸75g溶于ddH₂O或DEPC水中，最后补足ddH₂O定容至1000ml，高压灭菌备用。该液为储备液，-20℃储存。