图23-2 反转录酶的作用机理

　　（三）反转录酶

　　反转录酶（Reverse transcripatase）是以RNA为模板指导三磷酸脱氧核苷酸合成互补DNA（cDNA）的酶。哺乳类C型病毒的反转录酶和鼠类B型病毒的反转录酶都是一条多肽链。鸟类RNA病毒的反转录酶则由两上亚基结构。真核生物中也都分离出具有不同结构的反转录酶。这种酶需要镁离子或锰离子作为辅助因子，当以mRNA为模板时，先合成单链DNA（ssDNA），再在反转录酶和DNA聚合酶Ⅰ作用下，以单链DNA为模板合成“发夹”型的双链DNA（dsDNA），再由核酸酶S1切成二条单链的双链DNA。因此，反转录酶可用来把任何基因的mRNA反转录成cDNA拷贝，然后可大量扩增插入载体后的cDNA。也可用来标记cDNA作为放射性的分子探针。

　　（四）核酸外切酶

　　大肠杆菌核酸外切酶Ⅲ（exonuclease Ⅲ）是从带3’-OH末端的双链DNA，按3’→5’方向切除5’单核苷酸：

　　大肠杆菌核酸外切酶Ⅶ则是从单链DNA的3’端和5’端切除寡核苷酸（两种形式）：

　　（1）（2）

　　前一种酶需要镁离子作辅助因子才有活性；后一种酶则不需镁离子，因此即使在有螯合剂EDTA的情况下也有活性。另一种从噬菌体λ感染的大肠杆菌中提取的λ核酸外切酶是从带有5’磷酸末端的双链DNA上，逐个切除5’单核苷酸，在反应时需要镁离子：

　　（五）核酸酶S1

　　核酸酶S1（nuclease S1）主要是降解单链DNA或单链RNA。对单链DNA的活性更高。它的用途是切除DNA片段的单链末端使之成为平头末端，切开合成dscDNA时形成的“发夹”环以及分析DNA-RNA杂合子的结构。

　　（六）DNA酶

　　DNA酶Ⅰ（DNaseⅠ）是随机水解双链或单链DNA的一种内切酶，使DNA分子降解成带有5’磷酸末端的单核苷酸和寡核苷酸的混合物：

　　在进行重组DNA研究时，必须注意防止DNA酶的污染，否则制备的DNA样品将会降解。因此器皿或试剂高温处理，样品中加EDTA，或放置冰上以破坏或抑制酶活性。

　　（七）RNA酶

　　RNA酶A（ribonuclease A）作用于嘧啶核苷酸的3’磷酸根上，切开与相邻核苷酸连接的5’磷酸键。另一种RNA酶T1只作用于鸟嘌呤核苷酸的3’磷酸根，切开与相邻核苷酸连接的5’磷酸键。人体的分泌物如唾液，汗液中都含有RNA酶。因此在操作RNA样品时，必须戴手套，实验用的玻璃器皿都要经250℃烘烤4h（RNA酶耐热），或用RNA酶的抑制剂处理。

　　（八）连接酶

　　最常用的是T4DNA连接酶（T４DNa ligase），催化双链DNA中相邻的3’OH与5’磷酸根之间形成磷酸二酯键，它可用来连接具有粘性末端的两个DNA片段，或连接两个平头末端的DNA片段，使之成为一个重组DNA分子。可是这种酶只能连接双链DNA而不能连接单链DNA分子。T4RNA连接酶则可在单链DNA分子或RNA分子的5’磷酸根和3’-OH之间催化生成共价键。

　　（九）末端转移酶

　　末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotide transferase）的作用是将脱氧核苷酸加到DNA分子的3’-OH末端。

　　（十）碱性磷酸酶

　　从DNA或RNA的三磷酸脱氧核糖核苷酸或三磷酸核糖核苷酸上除5’-磷酸根残基。一般的用途是用这种酶处理DNA或RNA后，在5’端上标记32P。在经限制性内切酶酶切DNA片段后，用碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）处理可以阻止酶切的片段自身连接，这在克隆DNA片段时特别有用。