常用的逆转录酶有两种,即禽类成髓细胞性白血病病毒(Avian myeloblastosis virus, AMV)和莫洛尼鼠类白血病病毒(Moloney murine leukemia virus, MO-MLV)的逆转录酶(RT)。一般情况下用Mo-MLV-RT较多,但模板RNA的二级结构严重影响逆转录时,可改用AMV-RT,因后者最适温度为72℃,高于Mo-MLV-RT的最适温度(37℃),而较高的反应温度有助于消除RNA的二级结构。 一步法扩增(one step amplification)是为了检测低丰度mRNA的表达,利用同一种缓冲液,在同一体系中加入逆转录酶、引物、Taq酶、4种dNTP直接进行mRNA反转录与PCR扩增。发现Taq酶不仅具有DNA多聚酶的作用,而且具有反转录酶活性,可利用其双重作用在同一体系中直接以mRNA为模板进行反转录和其后的PCR扩增,从而使mRNA的PCR步骤更为简化,所需样品量减少到最低限度,临床小样品的检测非常有利。用一步法扩增可检测出总RNA中小于1ng的低丰度mRNA。该法还可用于低丰度mRNA的cDNA文库的构建及特异cD-NA的克隆,并有可能与Taq酶的测序技术相组合,使得自动反转录、基因扩增与基因转录产物的测序在一个试管中进行。 最近Cetus公司推出rTth逆转录酶,兼具有DNA多聚酶的活性,对于RNA的发展起了很大的推动作用。有关rTth逆转录酶法参考第四节 有关内容。 十一、定量PCR 1.DNA-PCR定量用同位素标记的探针与电泳分离后的PCR扩增产物进行杂交,根据放射自显影后底片曝光强弱可以对模板DNA进行定量。Abbot等利用这种方法对人类T细胞白血病反转录基因进行了定量研究。 PCR扩增产物用专为检测ds-DNA而设计的微量荧光计定量,利用染料H33258专与双链DNA结合而使荧光增强50倍的特性。可以从标准模板系列稀释扩增产物量曲线上读出样品中模板DNA的量或拷贝数,达到PCR定量的目的。 利用倍比稀释模板作系列稀释PCR,求出最低(PCR-EB)检测限来比较,也是常用的半定量PCR方法。 2.mRNA-PCR定量由于MRNA-PCR定量需经两个酶(RT和Taq)催化,因而影响因素较多。1989年Wang等报道了低丰度mRNA绝对定量方法。利用浓度已知且与待测靶mR-NA序列相同的内对照mRNA(其片段长短不同,便于PCR扩增后产物的分离),在同一体系中,用相同的由32P标记的引物与待测mRNA一同进行逆转录和PCR扩增,扩增产物电泳后,分别测定二者产物放射性强度,由预先制备的标准曲线推算出每个样本特异mRNA的量。Gilliland等的结果表明,在1ng总RNA中可以对小于1pg的特异mRNA进行定量。这一定量方法在肿瘤、代谢失调、基因表达调控等研究中均有重要意义。 (责任编辑:泉水) |