十一、辣根过氧化物酶标记核酸探针法

　　此法标记原理如下图所示：

　　标记的HRP部分催化底物化学发光反应：氨基苯二甲酰肼　氨基苯二甲酸

　　+N₂+光→X-光片上感光10～20min显定影。

　　光亮子在酚、萘及胺类等增强剂促进下，而使光亮增强。

　　这种方法就是利用特殊的酶底物，氧化后把产生的能量转变为光能放出，称为化学发光。杂交后与探针结合的酶催化相应的发光剂，经增强剂将光能放大，在X光片上显示杂交信号。此方法灵敏度与同位素标记水平相当，简便快速，安全，是一种特异性好的检测手段，具有广泛的应用前景。

　　HBV-DNA的HRP标记方法：质粒中插入HBV全基因组DNA，长3.2kb，载体为PBR322质粒，4.3kb。将质粒DNA用三蒸水稀释成10ng/μl，取20μl放入EP管，100℃变性5min，加入20u HRP标记试剂，混匀，加入戊二醛20μl混匀，37℃10min，此时可立即使用，或放在冰浴中10～15min内使用，或加入50%去离子甘油-20℃保存供分子杂交用，可存放6个月。

　　十二、用聚合酶链反应标记高活性DNA探针

　　聚合酶链反应（PCR）或称体外基因倍增技术，它利用一对位于待扩增的DNA序列两端的取向相对的DNA引物，在DNA聚合酶的介导下，经过多次变性，退火和延伸过程的重复性循环，大量合成靶DNA序列。在标记dNTP存在时，经PCR反应产生的靶DNA片段均参入了标记物，用此法标记的探针标记率高达97.4%。此法重复性好，简便、快速、特异、不要求模板DNA的纯度，可以大量制备。此法有普遍应用价值。

　　标记方法如下：待标DNA模板1ng,50mmol/L KCl, 10mmol/L Tris-HCl(pH8.4),2.5mmol/L MgCl₂ dATP、dCTP、dGTP各200μmol/l dTTP150μmol/Ll,Bio-11-dUTP 50μmol./L, 引物各1μmol/L，明胶200μg/ml，2u Taq DAN聚合酶，总反应体积为100μl。混匀后，加石蜡油封顶，94℃和55℃各2min，72℃3min，经25个循环后，可产生5～10μg标记探针，需时仅4h。乙醇沉淀扩增的产物后，溶于100μl TE中，分装-20℃。