第一节 在细菌学中的应用 免疫细胞化学在细菌学中主要用于菌种鉴定和抗原结构的研究。细胞都各自有其特异性抗原,应用特异性抗体的荧光素或酶标记物,可以鉴定任何一种细菌。已经成功地用于鉴定几乎所有致病菌的纯培养。尤其是应用免疫荧光技术具有较其他血清学方法简便、快速和敏感等优点,并能直接进行细菌形态观察。可用于鉴定的材料也比较多样,如培养物、感染组织、病人分泌排泄物,外环境中采集材料(土壤、水、杂物等)。由于此法对某些传染病原能较常规方法作出更快速的诊断,因而具有特殊意义。 免疫细胞化学方法用于研究细菌抗原结构和形态学观察,由于单克隆抗体的应用,比其他方法更为有效。 图16-1 免疫荧光在病原细菌诊断程序中的应用时机 从患者咽部粘膜用棉拭子取标本,作涂片用甲组溶血性链球菌荧光抗体染色,能够很快作出诊断。对于痢疾杆菌、霍乱孤菌、布氏杆菌、炭疽杆菌和脑膜炎双球菌、肺炎双球菌等的实验诊断均有较好的效果(如表16-1)。 利用间接免疫荧光或酶标记抗体法,检测患者血清中的抗体更有价值,广泛用于临床诊断和流行病学研究。 表16-1 免疫荧光细胞化学方法在细菌诊断中的应用评价 菌种 疾病 标本 方法 敏感性 特异性 意义 甲组链球菌 急性咽峡炎猩红热 咽部培养物 DIF 高 高 诊断 急性风湿热 乙组链球菌 新生儿败血症 阴道拭子 DIF 高 中 快速 脑膜炎 临床标本 鉴定 牛型乳腺炎 培养物 致病性大肠杆菌 婴儿腹泻 大便 DIF 高 中 过筛 杆菌 伤寒沙门氏菌 肠伤寒 大便 DIF 高 高 诊断 沙门氏菌 肠炎 大便 DIF 高 高 诊断 (大多数血清型) 肠热脑膜炎 食品 过筛 环境标本 培养物 志贺氏菌属 宋内氏菌 菌痢 大便 DIF 高 高 快诊 福氏菌 菌痢 大便 DIF 高 高 快诊 百日咳杆菌 百日咳 鼻咽涂片 DIF 高 高 快诊 流感嗜血杆菌 细菌性脑膜炎 脑脊髓 DIF 高 高 快诊 肺炎球菌 细菌性脑膜炎 脑脊髓 DIF 高 高 快诊 脑膜炎球菌 细菌性脑膜炎 脑脊髓 DIF 高 高 快诊 出血点 (差) 军团菌病 小叶肺炎 痰,肺渗出物 DIF 高 高 诊断 肺组织切片 IIF 快诊 李氏菌 李氏单核细胞 体液涂片 DIF 高 高 诊断 增多症 组织切片 布氏杆菌 布氏症 胎盘 DIF 高 高 诊断 (牛、羊、猪型) (人、畜) 病理组织培养物 DIF 高 高 诊断 结核杆菌 结核病 痰及其消化液 DIF 高 高 诊断 胎儿孤菌 孤菌病 子宫阴道粘液 DIF 高 中 诊断 类丹毒菌 动物感染 血液、组织、培养物 DIF 较高 高 诊断 放线菌 放线菌病 扁桃腺病理排泄物 DIF 高 高 诊断 钩端螺旋体 钩体病 尿沉渣,新鲜组织刮片或切片培养物 DIF 中 高 诊断 奈瑟氏淋球菌 淋病 结膜、皮肤破损,关节 液 DIF 较高 中 过筛 绿脓杆菌 肺炎 病理组织 DIF 较高 中 诊断 类鼻疽杆菌 类鼻疽 排泄物 DIF 高 高 诊断 病理组织 DIF 中 高 诊断 马疽杆菌 鼻疽 排泄物 DIF 高 高 早诊 病理组织 脆弱类杆菌 败血症 血及其他有关临床标本 DIF 高 较高 诊断 黑色素源标菌 牙周病物 病变部位分泌物 DIF 高 高 辅诊 脏器脓肿 梭状芽胞杆 肉毒中毒 食物 DIF 菌属 动物黑腿病 变部组织 羊炭疽 大便等 DIF 高 较高 辅诊或诊断 气性坏疽 破伤风 结肠炎等 沙眼衣原体 沙眼 结膜刮片 DIF 高 高 诊断 (引自,黄策:免疫荧光和荧光免疫。1983) 一、甲组溶血性链球菌的快速检查法 (一)试剂制备 用抗甲组溶血性链球菌的抗体,以FITC标记,制成荧光抗体,再用C和G链球菌充分吸收;或用抗I型链球菌M蛋白成分的血清,标记后吸收,都有可靠的特异性。 (二)检查方法 (1)以棉拭子擦拭患者咽部粘膜,取标本。 (2)将拭子浸入1ml肉汤小试管内,37℃培养2~3h。 (3)取出棉拭了作分离培养,常规鉴定。将肉汤液离心3~4min,3000r/min,弃上清,沉淀加0.01mol/l Ph7.2 PBS 洗涤,再离心沉淀,弃上清。 (4)以沉淀涂片,直径约1cm,涂两个圆形区。 (5)将标本放入95%酒精中固定1min,然后浸入PBS中洗1次,取出室温晾干。 (6)直接法染色,左侧标本作对照,加非溶血性链球菌荧光抗体染色。右侧加甲组溶血性链球菌荧光抗体染色。置湿盒中孵育20~30min,再用PBS洗2次,每次5min,振动洗涤,滤纸吸干标本周围的水。 (7)加缓冲甘油封裱,立即荧光显微镜观察。 免疫荧光检出的阳性率较培养法为高,因为前者可以检出抗菌素治疗后的死菌。二者符合率达95%。 二、脑膜炎双球菌的快速检查法 (一)制备荧光抗体 可用多价和I、II、III、IV型单价的脑膜炎球菌抗血清,分别制备多价和单价荧光抗体。 (二)检查方法 用患者咽拭子,脑脊液或培养标本制备涂片,晾干,火焰或乙醇固定,37℃中染色30min,荧光显微镜检查。 抗脑膜炎双球菌的荧光抗体有很高的特异性,可以快速检出和鉴定脑膜炎双球菌。有人应用免疫荧光检查267例脑膜炎病人脑脊液中脑膜炎双球菌,阳性率73.4%,培养和普通染色则只分别为41.9%和34.4%。 三、霍乱弧菌和副霍乱弧菌的快速检查法 霍乱和副霍乱是严重的传染病,快速诊断才能及早防治。取病人粪便标本直接涂片荧光抗体染色检查,与常规培养法比较,具有快速特异和检出率很高的优点。尤其适用于急性期病人的诊断。 四、鼠疫杆菌的快速检查法 鼠疫是烈性传染病,快速及时的诊断对于控制流行和救治病人有决定性意义,免疫荧光快速诊断方法是一种特异和敏感的手段。直接法和间接都可应用,以直接法更简便。 五、炭疽杆菌的快速检查法 炭疽也是一种烈性传染病,早期快速诊断对救治病人有决定性意义。免疫荧光检查方法对炭疽杆菌的检出率很高。应用抗夹膜荧光抗体检查炭疽杆菌有十分确定的诊断意义。也可用间接法检测血清中抗夹膜抗体。 六、致病性大肠杆菌的快速检查法 (1)制备当地常见的致病性大肠杆菌荧光抗体。 (2)取病人大便标本或直肠拭子以生理盐水搅和涂片,晾干,火焰固定。 (3)直接法免疫荧光染色,立即荧光显微镜检查。 由于本菌较其他非致病性大肠杆菌组有特殊的抗原,不易发生强交叉反应。所以,在儿童肠炎和引起人群暴发性肠炎时更准确、快速和简便。 七、结核杆菌的快速诊断方法 结核杆菌感染机体后可以诱导产生抗体,可用间接法检查血、胸腹水和脑脊液中的抗体。 也可用抗结核杆菌的荧光抗体直接法检查抗原。 八、其他细菌的快速检查方法 对军团杆菌、布氏杆菌、土拉杆菌、产气夹膜杆菌等的快速诊断,效果良好。 九、钩端螺旋体的检查法 (1)根据当地钩端螺旋体的型别制备多价抗体、标记FITC制成荧光抗体。 (2)检查方法: ①血液标本的检查:取发热期的病人或发病动物的血液约2ml,制取血浆,并加入钾明矾(0.058g/ml),振荡混匀后置室温10~15min,然后中速离心沉淀,取沉渣涂片,晾干,95%酒精固定。免疫荧光染色,镜检。 ②尿液标本检查:取病人或动物尿液约2~3ml,高速离心,取沉渣涂片,无水乙醇固定,免疫荧光染色,镜检。 ③脏器标本的检查:取发病动物的肾脏皮质部分,以刀片切出整齐断面,滤纸吸去血液,再以洁净载玻片压印制片,晾干后以丙酮在4℃固定。经10%甲醛固定的组织可作冰冻切片,依丙酮-乙醇-甲醇的次序固定,荧光抗体染色前以3%表面活性剂如Tween20处理切片,据称,这样可使荧光强度增加4倍。 ④培养液检查:同尿处理。 ⑤特异性抗体的检查:用适当血清型的钩端螺旋体作抗原,用间接法检查病人血清中的特异性抗体,可用于流行病学调查和临床追溯诊断。此检查适用于人类和家畜等。 (责任编辑:泉水) |