⑤彻底清洗，应用0.5mol/L Tris缓冲液pH7.2,不含BSA

　　⑥继之用0.5mol/L Tris缓冲液pH7.6,含1%BSA冲洗

　　⑦0.5mol/L Tris缓冲液pH8.2,含1%BSA，室温孵15min

　　⑧羊抗兔IgG标记以15nm金粒，应用0.5mol/l Tris缓冲液pH8.2、含1%BSA稀释1：40，孵育2h，室温

　　⑨0.5mol/L Tris缓冲液pH7.4 冲洗

　　⑩蒸馏水冲洗

　　（2）镍网面B，重复①～⑩，只在第④时更改另一特异性一抗，在⑧时羊抗兔IgG标记以5nm金粒。

　　（3）铀铅双重染色，电镜观察，可见二种不同直径金粒标记。

　　注意事项：①所有溶液均须经加有微孔滤纸（0.45μm孔，国内外现均有商品提供）的注射器过滤，过滤后直接以注射器冲洗。②滤纸最好用无纤维吸水滤纸。③冲洗在胶金标记技术上是个决定性关键，仅次于抗体血清的纯度。笔者的体会是一般应漂洗3×5min，以注射器喷水漂洗效果优于杯漂洗法，但漂洗水流需与网面平行，勿使水压破坏切片。

　　四、免疫电镜金—银法染色技术

　　关于免疫金银细胞化学的原理、试剂配制和光镜显示技术在本书第五章　已作了较详尽的叙述。免疫金银细胞化学技术说可应用于电镜水平。一般用于包埋前染色。其主要操作步骤如下：

　　（1）组织固定振动切片机切片10～30μm。

　　（2）人3%正常羊血清，含0.1%Triton X—100 的PBS孵育30min，以封闭非特异性结合部位

　　（3）1%硼氢化钠的PBS孵育30min。

　　（4）一抗37℃，2h。

　　（5）PBS含0.1%BSA pH7.4 冲洗3min×3次。

　　（6）PBS含0.1%BSA pH8.2 冲洗3min×3次。

　　（7）人10～15nm金标羊抗兔抗血清，工作浓度约1：10，37℃孵育45min。

　　（8）硝酸银液物理显影（详见第五章　第六节　）。

　　（9）在解剖显微镜下取免疫反应阳性部位，人1%锇酸后固定20min，常规脱水，树脂包埋。

　　（10）超薄切片机切0.1μm左右半薄切片,定位阳性反应部位,制超薄切片。如有暗视野微镜则更有助于定位。在暗视野前景下，金银粒呈金黄色闪光颗粒，即使微量金银也可定位，微镜则更有助于定位。在暗视野前景下，金银粒呈金黄色闪光颗粒，即使微量金银也可定位。

　　（11）铀—铅电镜染色，电镜观察。

　　免疫金银法敏感度高，金银颗粒电子密度高，反差强；应用包埋前染色可先定位阳性反应部位再作电镜超薄切片，获得阳性反应机率高，特别适用于含微量抗原的部位，如突触等。其不足是须经暗室显影，手续较烦杂，包埋前免疫染色易增加非特异性染色。另外，由于单个金粒周围结合的银粒不是固定的，受多种因素影响。因此，电镜免疫金粒染色法的金粒银粒计算不适于做半定量观察，误差较大。