第二节　染色方法

　　一、本科标抗体法

　　酶标抗体技术是通过共价键将酶连结在抗体上，制成酶标抗体，再借酶对底物的特异催化作用，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，于光镜或电镜下进行细胞表面及细胞内各种抗原成分的定位。

　　（一）酶的种类及特点

　　从理论上讲，用细胞化学方法能显示的酶，均可用于标记抗体，进行ICC染色，但实际上在ICC中所能用的酶并不多。现将常用的几种酶列于表4-1，供选用时参考。

表4-1 免疫细胞化学常用的酶

　　Sternberger(1986)指出，用于标记的酶应具备以下几点①酶催化的底物必须是特异的，且容易被显示，所形成的产物易于光镜或电镜下观察；②所形成的终产物沉淀必须稳定，即终产物不能从酶活性部位向周围组织弥散，影响组织学定位；③较易获得的酶分子，最好有商品出售；④中性pH时，酶应稳定，酶标记抗体后，保存1～2年活性不应改变，且酶的催化活性（Turnover）越高越好；⑤酶标过程中，酶与抗体连结，不能影响二者的活性；⑥被检测组织中，不应存在与标记酶相同的内源性酶或类似物质。

　　其中，①②两点甚为重要，因为并非容易显示的酶均能形成不可溶性的复合物。一般认为，辣根过氧化物酶（Horseradish peroxidase , HRP）较佳，是最常用的一种酶。HRP广泛分布于植物界，以植物辣根（西洋山嵛菜）的叶内含量最丰富而得名。它是由无色的酶蛋白和深棕色的铁卟啉结合组成的一种糖蛋白，糖占16%～18（8条糖链分布在HRP分子表面），分子量40kD，最适pH5～5.5，最适温度40～45℃； pH4～11，50℃以下均较稳定，易溶于水和58%以下的饱和硫酸铵溶液。酶的活性中心含铁卟啉，称辅基，最大吸收光谱为403nm，而其余非活性的酶蛋白部分吸收光谱为275nm，HRP的纯度是用二者的光密度比值（Od 403/275）衡量，Reinheit Zahl (RZ)表示。一般认为，标记酶的RZ值为3.0左右，不应小于2.8，RZ值越小，酶的纯度越差，例如RZ值为0.6的酶，含非活性的酶蛋白量高达75%。对于纯度低、质量差的酶，需纯化后使用。

　　除HRP外，碱性磷酸酶（Alkaline phasphotase, ALP）和葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase, GOD）也较常用。ALP分子量约为HRP的2～3倍，最适pH9.0～9.5左右，比较稳定，内源性ALP也较易消除，大部分均可被左旋咪唑（Levamisole,分子量240.8kD）抑制，但肠粘膜表面的内源性ALP活性不受影响。目前所用的ALP大多系由牛的肠粘膜提取制得，所以肠粘膜等呈强阳性反应。

　　ALP最初是由Bulman等用于标记抗体的。选用不同的底物，可形成不同颜色的终产物，例如以萘酚（As-Mx）和快蓝（Fast Blue, FB）为底物，生成蓝色沉淀。用快红（Fast Red, FR）代替FB，形成红色不溶沉淀。与HRP/4-氯-1-萘酚（CN）或DAB形成的沉淀形成鲜明对比，但FB、FR等沉淀物溶于有机溶剂，不能进行脱水、透明等处理。据报告，利用新品红（New fuch－sine ）显色，形成的红色沉淀产物不溶于有机溶剂，不褪色，轻度核复染后，可制成半永久性保存标本。

　　GOD所催化的底物为葡萄糖，电子供体为对硝基四唑蓝（P-Nitroblue Tetrazolium）,终产物为不溶性的蓝色沉淀，比较稳定。从理论上讲GOD较ALP、HRP为佳，因为哺乳动物组织内不存在内源性GOD，但其分子量较大，具有较多的氨基，在标记时易形成广泛的聚合，影响酶的活性，故GOD主要用于ICC双重染色和两种酶的放大技术。

　　（二）本科标抗体的制备（Boosma,DM, 1983）

　　酶标抗体与荧光色素标记抗体不同，它需借助桥-偶联剂的作用，将酶连结在抗体分子上。偶联剂是一种双功能试剂，具备3个基本特征：①偶联剂与抗体和酶之间的连结，必须是不可逆的，即借共价键连结；②偶联剂不应影响酶和抗体的活性；③不能因偶联剂的加入，使酶与组织成分了生非特异结合。

　　在HRP标记抗体中，常用的偶联剂有戊二醛、过碘酸钠及Maleimide等，现简介如下。

　　1．戊二 醛标记法　　戊二醛为制备各种酶标抗体最常用的偶联剂。市售戊二醛往往含有戊二酸、丙烯释及戊二醛自身聚合本等杂质，故需纯化后使用。戊二醛的纯度用含杂质的二醛的单体戊二醛的OD比值表示，它们的最大吸收光波长分别为235nm 和280nm，二者的OD比值（235/280）小于3时，制备酶标抗体的效果较好，大于3时，需经蒸馏或Sephadex G-10柱层析或活性碳吸附等处理，除去杂质后应用。其制备方法分一步法和两步法；基本原理相同，是使戊二醛的两个醛基之一与酶蛋白的赖氨酸结合，另一醛基与免疫球蛋白上的氨基结合，将酶连结于抗体上。

　　（1）一步法：将酶、抗体、戊二醛按一定比例混合，经透析除去标记物中剩余的戊二醛，制得酶标抗体。优点是简单省时，缺点是反应程度不易被控制，因为酶蛋白分子和抗体蛋白分子同戊二醛间的反应速率不同，抗体蛋白的氨基数远较HRP为多，与戊二醛反应快，因此在戊二醛的作用下，抗体蛋白易通过分子内和分子间的彼此交联，形成较大的聚合体，而与酶蛋白分子间的交联相应减少，影响酶的标记。据Nakane等推算，加入的HRP仅20%与抗体连结，标记率较低（约1%～5%）很难获得理想的酶标抗体。

　　（2）二步法：首先用过量的戊二醛与HRP反应（HRP：戊二醛为1：105），以保证酶分子仅与戊二醛的一个醛基结合，另一个醛基游离；然后用层析法除去多余的戊二醛，制成活性HRP（HRP-戊二醛复合物），再加入过量的抗体，使活化HRP上剩余的醛基与抗体蛋白分子上的氨基结合，制成酶标抗体。过量的抗体可以保证酶与抗体间均匀连结，避免酶本身聚合。根据所用的HRP与抗体（IgG）比例不同，酶标记率各异，平均为5%～25%。标记步骤如下：

　　①10～15mg HRP(RZ=3.0),溶解于0.2ml 1.25%戊二醛中（0.1mol/L磷酸缓冲液配制），18h室温。

　　②透析或 Sephadex G-25柱层析（0.15mol/l NaCl平衡），去除过量的戊二醛，收集活化HRP。

　　③浓缩活化HRP至10mg/ml左右，加入抗体5mg(1.0ml 0.15mol/L NaCl 溶解)。

　　④碳酸盐缓冲液（pH9.5）调整pH至9.0～9.5,使抗体与活化HRP结合，4℃24h。

　　⑤加入0.1ml赖氨酸缓冲液，阻断未反应的醛基，4℃，2h。

　　⑥用半饱和硫酸铵沉淀5次，对PBS透析24h，4℃，换3次PBS，除去硫酸铵（10000rpm/min,30min）。

　　⑦或用凝胶色谱法（Sephadex G-200/Sephacryl S-200） 等分离标记抗体。

　　注意：该方法要求HRP的RZ值在3.0左右，游离氨基较少，与戊二醛反应后，制成的酶标抗体大部分为单体；而RZ值小于2.8的HRP，含有较多的游离氨基，与戊二醛反应后，易形成多聚体，使方法的敏感性下降。

　　2．过碘酸盐氧化法　　严格地讲，过碘酸钠（Sudium periodate）不是一种真正的偶联剂，其本身并非作为桥连结在抗体和酶之间，而是借助于过碘酸钠的氧化作用，将酶连结在抗体上。该方法仅适于含糖较丰富的酶（如HRP）的标记。我们知道，HRP分子的糖本身与酶活性无关，利用过碘酸钠氧化这部分糖分子内的-CH基，使之生成-CHO基，再与抗体蛋白的游离氨基反应，生成Shiff’s碱。此Shiff’碱在pH降低时呈可逆性解离，所以经氢硼化钠（NaBH4）还原，形成稳定的酶标抗体复合物（图4-1）。为防止生成的-CHO基与酶蛋白氨基自身交联，预先可用二硝基氟苯（Dintro-fluorobenzene）处理HRP，阻断分子内的ε-、α-氨基。

图4-1　过碘酸盐氧化原理

　　过碘酸盐氧化法，酶的RZ值≥3时较佳；RZ<3时，糖含量较少，游离氨基较多，氧化时酶易发生本身聚合，影响酶标抗体的产量，据报告，适当地控制过碘酸盐溶液及反应条件，几乎所加入的HRP和抗体均形成酶标抗体，其标记率为70%左右。具体步骤为：

　　（1）4mg HRP(RZ=3.0)溶于1.0ml双蒸水中。

　　（2）加0.2ml新鲜配制的0.1mol/LNaIO4，轻轻摇动混合20min,肉眼可见液体内棕黄变成深绿色。

　　（3）对0.1mol/L醋酸盐缓冲液（pH4.4）透析，20h，4℃。

　　（4）调整HRP液体的pH至9.5(一般加入20μl0.2mol/L碳酸盐缓冲液pH9.5),立即加入抗体(IgG)8.0mg/Fab 3.0mg (0.01mol/L碳酸盐缓冲液溶解),轻轻混匀后,置室温2h。PH≤8.5时,抗体的NH2基被氧化生成NH3+,后者不能与CHO基反应,所以,保持pH9.0～9.5非常重要。

　　（5）加入0.1ml新鲜配制的0.4%NaBH4 溶液，置1～4℃2h，以稳定酶标抗体复合物。

　　（6）经透析等去除未反应的NaBH4 ，避免还原过度。然后经盐析或柱层析等方法分离酶标抗体（方法同戊二醛法）。

　　如此制得的酶标抗体，加入终浓度1%牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin, BSA）分装后于-80℃可保存数年；亦可加入6%等量甘油，混匀置-20℃/4℃保存1年左右。上述两种标记法是ICC研究中最常用的酶标抗体制备方法。

　　3．Maleinmide法　　 上述酶标抗体（IgG）的分子量较大，对抗体的穿透性有一定影响，而在制备过程中，需经两次纯化，即多聚体与单体及单体与非标记抗体的分离。已知单体（1个HRP分子标记1个IgG分子）的分子量为190～200kD，非标记抗体为146～150kD，用凝胶过滤法很难将二者分开。所以,Sternberger等进行了抗体片段Fab的标记。用植物性蛋白酶---木瓜酶（Papain）水解抗体蛋白，可获得一个无抗体活性稳定的Fc段结晶和两个相同的抗原结合片段（Fab），此Fab段为单价，分子量50kD,HRP标记后，单体分子量为90kD,较容易将单体和非标记的Fab段分离。在此基础上，Imagawa(1982)又进行了改良，引入了N-羟基丁二酰酯（Maleinmide），标记抗体的特定部位---Maleinmide法。该方法的主要原理是：（1）借助双功能试剂Maleinmide活化HRP，使其具有与—Hs 基反应的能力；（2）利用胃蛋白酶水解IgG，IgG重链在近羧基端被切断，这样在绞链区（Hinge region）至少可以保留一个S-S键，从而得到一个具有双价抗体活性的F（ab＇）2段。该S-S键与抗体活性无关。可以通过加入硫基乙醇（2（β）-Mercapto ethanol, HSCH2CH2OH）使其断裂，被还原成—HS基 。如此双价抗体活性的F（ab＇）2片段即变为带有—Hs 基的单价Fab’片段，后者再与活化的HRP结合，便制成了酶标抗体Fab＇。由于空间遮蔽的关系，绞链区即使存在两个—HS基，也只能有一个能与酶结合，另一个—HS基不能与酶反应，即酶与抗体Fab’段结合比例为1：1，因此酶标抗体Fab’段绝大多数是单体，很少形成多聚体。在标记过程中，应用过量的活化HRP，还能避免非标记抗体Fab＇段的存在。Fab＇段的分子量与Fab段相似（50kD左右），所以酶标后Fab＇亦较容易与未标记的Fab＇分离。此标记方法多用于酶免疫分析研究，其步骤为：

　　①6mg HRP溶于1.0ml PBS(pH7.0)中。

　　②4mg Maleinmide 溶于0.5ml N, N二甲基酰胺（N,N-dimethylformamide）中。

　　③将上述两种液体充分混合，持续搅拌1h,30℃。

　　④离心取上清，经0.1mol/l PB(pH6.0)平衡的Sephadex G-25柱层析，收集含有蛋白部分的洗脱液，浓缩，制得活化HRP。