ELISA法检测幽门螺杆菌抗体

　　1983年Warren和Marshall从人胃粘膜成功地分离出幽门螺杆菌（Hp）之后，Hp与胃炎、消化性溃疡的相关性引起人们极大的兴趣。人们推测其可能成为这类疾病的致病因素之一。许多研究者正进一步探索其致病机理，并从不同角度寻找快速、可靠的检测方法。迄今为止，检测Hp的方法包括组织标本培养，切片染色，细菌直接涂片染色，快速尿素酶测定及¹³C尿素呼吸试验和¹⁴C尿素呼吸试验等。除尿素呼吸试验外其余方法均需通过胃镜检查才能完成，鉴于取材困难，进一步寻找检测Hp感染的免疫学方不进非常必要的。国外有人用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测临床病人血清中有Hp抗体报道，国内尚未有这方面研究报告。本文报道建立一种检测人体抗Hp抗体的ELISA的实验结果及与细菌培养法和尿素酶测定法对比检测结果，研究证明本法特异、敏感、适用于大量标本普查和及时判断治疗反应，现将结果报告如下。

　　1　材料和方法

　　1.1　材料

　　①40孔聚苯乙烯微量凹孔板：上海塑料三厂产品。②酶联板离心篮：根据40孔酶联板本实验室自行设计制成。③DG—Ⅰ型酶联免疫检测仪：南京华东电子管厂产品。④试剂：过氧化物酶（HRP），R²＝3.2，美国Sigma公司产品。邻苯二胺（OPD）：上海白鹤化工厂产品，按文献配制。包被液：取碳酸钠1.59g加碳酸氢钠2.93g，蒸馏水1000ml配成。洗涤液：以上未加吐温—20的洗涤液100ml＋2％小牛血清＋4％聚乙二醇（PEG）。封板液：5％小牛血清。戊二醛固定液：25％戊二醛液，100ml装，Kochligh进口分装，用时稀释成0.25％戊二醛固定液。终止液：2NH₂SO₄。⑤抗原的制备：将澳大利亚皇家佩思医院的Hp标准菌株（NCTC11638）及从胃镜检查患者胃粘膜活检标本分离出的Hp菌株分别接种于心脑血平板，37℃培养5d后取菌落作生化与血清学鉴定（自制兔抗Hp抗体），然后取单个菌落移种于另一血平板，继续培养3d，经鉴定后将其大量增殖培养，3d后将菌苔刮下，置生理盐水中制成菌液，加福尔马林固定（0.1％～0.3％），4℃过夜，3000r/nin离心30min，沉淀3次，将最后1次沉淀悬于少量PBS液内，用比浊管没出细菌浓度，制成含菌3×10⁹ml，置冰箱冰冻，反复冻融3次，经显微镜检查无菌体存在后，制成可溶性抗原，采用Lowry氏法蛋白定量，－20℃保存备用。⑥临床血清标本：采自胃镜检查患者，随机采取1988年8～10月胃镜检查病人共38人，抽静脉血2ml，分离血清贮存－20℃备用。⑦阴性对照血清，进行ELISA测定，取其平均OD值作对照。⑧酶标羊抗人IgG结合物（SAHIgG—HRP）的制备：按过碘酸盐改良法，略加改进标记制成酶标抗体。即HRP8.0ml，22℃较搅20min。加乙二醇6滴，继续搅拌5min，对pH4.2，0.001mol/L醋酸盐缓冲液（用2molHC1调pH）透析过夜，中间换水4次，加羊抗人IgG（上海生物制品研究所产品）14mg，逐滴加pH，1.0mol碳酸盐缓冲液，使pH升到9.0～9.5，室温较搅2h，加硼氢化钠（4mg/ml）0.2ml，置4℃2h，对pH7.2，0.01molPB－0.4molNaCl缓冲液在4℃透析平衡。换水4次，收取透析袋内结合物，以50％饱和度硫酸铵溶液盐析去除游离酶后，测定精制结合物，E/P克分子比值合格后，将结合物小瓶分装置－20℃保存，备用。⑨尿素酶测定法和Hp的分离培养法参考文献进行。

　　1.2　方法　

　　并稍加改进，即：抗原包被微量滴定板：用包被液将抗原按2×10⁸亿/ml（含蛋白8.6μg）稀释后，每孔加100μ，离心篮离心20min2000r/min后，倒去孔内液体，然后加入0.25％戊二醛液50μl/孔，4℃固定30min，倒去戊二醛，用洗涤液洗3次（每次3min），加5％小牛血清液，200ml/孔，经37℃30min封板后倒去孔内液体。每孔加待检血清(1：100稀释)100ml，37℃保温1h后，如上洗涤3次，同时做阴性对照孔和空白孔。之后于各孔内加和新鲜稀释的酶标羊抗人IgG结合物100ml，37℃保温半小时，于各孔中加入2NH₂SO₄50μl终止反应后，于酶联测定仪以波长490nm测定OD值，将测得标本OD值（P）与阴性对照OD值（N）比（P/N），若P/N比大于或等于2.0为阳性。

　　2　结果

　　2.1　ELISA的建立

　　为了知道所制备的SAHIgG－HRP在是接ELISA中的活性（结合第一抗体，效价），将此酶标抗体稀释成1：16000，1：32000，1：64000，1：128000，1：256000，1：512000六种浓度，将作第一抗体的已知病人Hp感染阳性血清稀释成1：100包被微板的Hp抗原浓度为2×108mg/ml，按上述步骤和主法进行ELISA试验。结果表明，所标记的羊抗人IgG酶标抗体当稀释度为1：32000～1：512000时，它们的P/N值均为≥2.0，因此，了保证实验结果稳定采用个单位效价，即用1：256,000稀释度作正式实验（注1：512000为一个效价单位）。

　　为了解Hp抗原在包被微量滴定板中最适浓度，将Hp抗原用抗原包被液分别按蛋白浓度稀释成0.27，0.54，1.08，2.15，4.3，8.6，17.2及34.4μg/ml8种浓度，然后分别进行包被，与第一抗体阳性血清(1：100)和SAHIgG—HRP(1：256000)按上述步骤和方法进行ELISA试验。结果，当Hp抗原浓度为8.6～17.2％μg/ml时OD值最高，Hp抗原在34.4μg/ml时，OD值下降，因此Hp抗原包被量最适浓度为.8.6～17.2μg/ml。以后实验用此抗原浓度包板。

　　为了确定用ELISA测定病人抗Hp抗体的阳性血清浓度，用Hp抗原8.6μg包板，SAHIgG—HRP仍用二个单位（1：256000），将二份阳性血清混后后稀释成1：50，1：100，1：200，1：400和1：800五种浓度进行ELISA试验，测定OD值的结果。结果显示阳性血清稀释度与OD值呈较好的线性关系，当血清稀释度为1：50时OD值为1.521，1：100时OD值是1.172，P/N比值均大于2.0，故以后实验中第一抗体的血清浓度均用1：100的稀释度。

　　为了验证ELISA间接法用于检测Hp抗体的特异性，进行特异性吸收试验。选用8份Hp感染性血清以1：50稀释，加等量Hp菌悬液，混匀置37℃半小时，再置4℃过夜吸收后离心取上清液按上述实验条件和方法进行ELISA测定，结果见表1。

表1　特异吸收抑制试验结果

　　从表1结果可知，阳生血清经吸收1次后，OD值均较吸收前下降，特别8号血清前后相比下降了50％，由此均显示特异吸收抑制试验阳性，证明该8份阳性血清的抗Hp抗体是特异的。为了探索所建立的ELISA间接法检测抗Hp抗体的敏感度，选择6份抗p阳性血清按上述实验条及方法进行ELISA检测，同时与试管凝集试验和显微凝集试验进行比较，结果见表2。

表2　ELISA测定Hp抗体敏感比较结果

　　数字为稀释倍数的倒数

　　从表2结果表明，6份抗Hp抗体阳性血清用所建立的ELISA间接法测出的抗体效价均＞1：800，试管凝集试验测出的抗Hp抗体效价为1：160～1：640，显微凝集试验测出的抗Hp抗体效价为1：160～1：320，显然ELISA法比后两者方法敏感的多。

　　批内误差　将4份阳性血清标本在同一块板上按上述方法重复进行9次ELISA试验，计算各份标本检测OD值结果的变异系数（表3）。

表3　4份阳性血清重复9次ELISA检测(x)

　　从表3得知，批内误差范围是5.5％～8.1％，平均6.87％，显示按上述实验条件建立的检测Hp抗体的间接法ELISA的稳定性好，重复性佳。

　　批间误差　将5份阳生血清，按上述方法及实条件在1W内反复进行3次ELISA，计算各份标本检测OD值结果的变异系数（表4）。结果指出三批阳性标本的变异系数在0.74％～8.12％之间，平均4.67％，由此亦显示按上述实条件建立的检测Hp抗体的间接法ELISA重复性和稳定性均良好。