图18-5 DNA随机引物标记法 好,标记量大,杂交检出信号强。合成探针长度短,一般在20-50核苷酸之间,过长合成成本高,且易出现聚合酶合成错误,杂交时间长。太短则特异性下降。合成探针设计还应注意碱基组成G≡C含40%-60%,一种碱基连续重复不超过4个,以免非特异性杂交产生。还要注意探针自身序列内应无互补区域以免产生“发夹”结构,影响杂交。一个好的探针最终在实践中才能加以确认。另外,还有利用M13噬菌体载体可复制单链DNA的特点,复制合成DNA探针,利用转录载体(DNA),转录合成RNA探针。下面就GIBCo BRL公司(Bethesda Research Laboratories美国)的缺口平移法标记生物素试剂盒(bionick labeling system)为例介绍如下:
操作步骤: 将5μl 10x dNTP Mix.;-μl DNA(相当1μg需标记的DNA量);-μl灭菌蒸馏水加至45μl;再加5μl 10x Enzyme Mix.依次加入1.5-2ml离心管后。15000xg离心15秒钟。16℃保温1小时。加5μl Stop Buffer终止反应。乙醇沉淀,备用。 (责任编辑:泉水) |