C＝C₂－（C₂－C₁）（1－V）^A2/A1

　　式中A₁、A₂分别代表两容器的截面积：C₁、C₂分别表示容器中溶液的浓度；V为流出体积对总体积之比。当A₁＝A₂时为线性梯度，当A₁＞A₂时为凹形梯度，A₁＞A₂时为凸形梯度。

　　洗脱时应满足以下要求：①洗脱液体积应足够大，一般要几十倍于床体积，从而使分离的各峰不致于太拥挤。②梯度的上限要足够高，使紧密吸附的物质能被洗脱下来。③梯度不要上升太快，要恰好使移动的区带在快到柱末端时达到解吸状态。目的物的过早解吸，会引起区带扩散；而目的物的过晚解吸会使峰形过宽。

图16-6　梯度洗脱示意图

　　⒊洗脱馏份的分析 按一定体积（5-10ml/管）收集的洗脱液可逐管进行测定，得到层析图谱。依实验目的的不同，可采用适宜的检测方法（生物活性测定、免疫学测定等）确定图谱中目的物的位置，并回收目的物。

　　⒋离子交换剂的再生与保存离子交换剂可在柱上再生。如离子交换纤维素可用2mol/:NaCl淋洗柱，若有强吸附物则可用0.1mol/l NaOH洗柱；若有脂溶性物质则可用非离子型去污剂洗柱后再生，也可用乙醇洗涤，其顺序为：0.5mol/l NaOH-水-乙醇-水-20％NaOH-水。保存离子交换剂时要加防腐剂。对阴离子交换剂宜用0.002％氯已定（洗必泰），阳离子交换剂可用乙基硫柳汞（0.005％）。有些产品建立用0.02％叠氮钠。

　　⒌离子交换层析的应用离子交换层析技术已广泛用于各学科领域。在生物化学及临床生化检验中主要用于分离氨基酸、多肽及蛋白质，也可用于分离核酸、核苷酸及其它带电荷的生物分子。

　　（三）高效液相层析法

　　高效液相层析法（HPLC）是近二十年来发展起来的一项新颖快速的分离技术。它是在经典液相层析法基础上，引进了气相层析的理论具有气相层析的全部优点。由于HPLC分离能力强、测定灵敏度高，可在室温下进行，应用范围极广，无论是极性还是非极性，小分子还是大分子，热稳定还是不稳定的化合物均可用此法测定。对蛋白质、核酸、氨基酸、生物碱、类固醇和类脂等尤为有利。

　　高效液相层析法的基本概念和分离理论与经典的液相色谱法及气相色谱法一致，因而其塔板理论及动力学理论等都可用于高效液相层析。

　　⒈高效液相层析仪典型的高效液相层析仪包括输液系统、层析柱与检测系统三部分。流动相用一高压泵输入。这种高压泵应满足以下条件：①流量恒定，无脉动，并有较大的调节范围。②能抗溶剂腐蚀。③有较高的输出压力，一般要达到15～300kg/c，也有的高达800kg/c。④泵的死体积要小。梯度洗脱装置必须具备两台高压泵，一台输送强溶剂，一台输送弱溶剂，两泵运转速度用电脑控制，并可按一定的要求改变流动相的组成，以改善分离效果。一般用微量注射器直接进样，也可采用六通阀门进样。HPLC中所用的检测器最多应用的是紫外吸收检测，灵敏度可达ng水平。此外，还有荧光检测器、示差析光检测器、电化学检测器等。

　　⒉HPLC的类型与应用

　　⑴液-固吸附层析：固定相是具有吸附活性的吸附剂，常用的有硅胶、氧化铝、高分子有机酸或聚酰胺凝胶等。液-固吸附层析中的流动相依其所起的作用不同，分为“底剂”和洗脱剂两类，底剂起决定基本色谱的分离作用，洗脱剂起调节试样组份的滞留时间长短，并对试样中某几个组份具有选择性作用。流动相中底剂与洗脱剂成分的组合和选择，直接影响色谱的分离情况，一般底剂为极性较低的溶剂，如正已烷、环已烷、戊烷、石油醚等，洗脱剂则根据试样性质选用针对性溶剂，如醚、酯、酮、醇和酸等。本法可用于分离异构体、抗氧化剂与维生素等。

　　⑵液-液分配层析：固定相为单体固定液构成。将固定液的官能团结合在薄壳或多孔型硅胶上，经酸洗、中和、干燥活化、使表面保持一定的硅羟基。这种以化学键合相为固定相的液-液层析称为化学键合相层析。另一种利用离子对原理的液-液分配层析为离子对层析。化学键合层析分：①极性键合相层析：固定相为极性基团，氰基、氨基及双羟基三种。流动相为非极性或极性较小的溶剂。极性小的组份先出峰，极性大的后出峰，这称为正相层析法，适用于分离极性化合物。②非极性键合相层析：固定相为非极性基团，如十八烷基（C₁₈）、辛烷基（C₈）、甲基与苯基等，流动相用强极性溶剂，如水、醇、乙腈或无机盐缓冲液。最常用的是不同比例的水和甲醇配制的混合溶剂，水不仅起洗脱作用还可掩盖载体表面的硅羟基，防止因吸附而至的拖尾现象。极性大的组份先出峰，极性小的组份后出峰，恰好与正相法相反，故称反相层析。本法适用于小分子物质的分离，如肽、核苷酸、糖类、氨基酸的衍生物等。离子对分配层析分：①正相离子对层析：此法常以水吸附在硅胶上作为固定相，把与分离组份带相反电荷的配对离子以一定浓度溶于水或缓冲液涂渍在硅胶上。流动相为极性较低的有机溶剂。在层析过程中，待分离的离子与水相中配对离子形成中性离子对，在水相和有机相中进行分配，而达到分离。本法优点是流动相选择余地大，缺点是固定相易流失。②反向离子对层析：固定相是疏水性键合硅胶，如C₁₈键合相，待分离离子和带相反电荷的配对离子同时存在于强极性的流动相中，生成的中性离子对在流动相和键合相之间进行分配，而得到分离。本法优点是固定相不存在流失问题、流动相含水或缓冲液更适用于电离性化合物的分离。

　　⑶离子交换层析：原理与普通离子交换相同。在离子交换HPLC中，固定相多用离子性键合相，故本法又称离子性键合相层析。流动相主要是水溶液，pH值最好在被分离酸、碱的pK值附近。

　　（四）亲和层析法

　　亲和层析是利用待分离物质和它的特异性配体间具有特异的亲和力，从而达到分离目的的一类特殊层析技术。

　　具有专一亲和力的生物分子对主要有：抗原与抗体、DNA与互补DNA或RNA、酶与它的底物或竞争性抑制剂、激素（或药物）与它们的受体、维生素和它的特异结合蛋白、糖蛋白与它相应的植物凝集素等。可亲和的一对分子中的一方以共价键形式与不溶性载体相连作为固定相吸附剂，当含有混合组份的样品通过此固定相时，只有和固定相分子有特异亲和力的物质，才能被固定相吸附结合，其它没有亲和力的无关组份就随流动相流出，然后改变流动组成份，将结合的亲和物洗脱下来。亲和层析中所用的载体称为基质，与基质共价连接的化合物称配基。

　　亲和层析纯化过程简单、迅速，且分离效率高。对分离含量极少又不稳定的活性物质尤为有效。但本法必须针对某一分离对象，制备专一的配基和寻求层析的稳定条件，因此亲和层析的应用范围受到了一定的限制。

　　亲和层析可用于纯化生物大分子：稀溶液的浓缩；不稳定蛋白质的贮藏；从纯化的分子中除去残余的污染物；用免疫吸附剂吸附纯化对此尚无互补配体的生物大分子；分离核酸是亲和层析应用的一个重要方面。

　　应用实例：2-胰凝乳蛋白酶的提纯

　　⒈亲和吸附剂（Σ-氨基-N-乙酰-Ｄ-色氨酸）的制备取一定体积的Sepharose4B加100mgCNBr。搅拌混合物，滴加2-8mol/l NaOH，使溶液pH维持在11.0。20℃左右，8-12分钟完成反应。在布氏漏斗中抽滤活化的琼脂糖，然后用20倍体积冷的0.1mol/l NaHCO₃（pH9.0）溶液洗涤。将上述活化的Sepharose4B与等体积0.1mol/l NaHCO₃（pH9.0并在冰箱中预冷）溶液混合，接着迅速加入α-胰蛋白酶抑制剂（Σ-氨基-N-乙酰-色氨酸甲酯）。抑制剂的最大用量为每毫升Sepharose 4B 65μmol/L。4℃缓慢搅拌约24小时，而后再用水和缓冲液反复地洗至没有游离的抑制剂为止。制得的亲和吸附剂在50mmol/l Tris-HCl缓冲液（pH8.0）中保存备用。

　　⒉分离 亲和吸附剂装柱后用50mmol/L Tris-HCl（pH8.0）缓冲液平衡（室温）。样品溶于同样缓冲液中并上柱，再应用同样缓冲液淋洗柱子。流速为30-60ml/小时，直至280nm无光吸收时停止洗涤，然后改用0.2mol/L醋酸缓冲液（pH3.0）洗脱。

　　（五）聚焦层析法

　　聚焦层析是一种操作简单、廉价的层析技术。它的原理是根据各种蛋白质的等电点不同进行分离的过程，因此本方法具有高分辨、高度浓缩和高度专一等特点。聚焦层析所用的凝胶首先用高pH溶液平衡，然后用多元缓冲液进行洗脱，多元缓冲液pH呈梯度下降。

　　聚焦层析所用凝胶主要有两种：MONOP和多元缓冲液交换剂（PBE）。其中MONOP是带孔小珠，孔中被带正电荷的胺基填充，适用于高效聚焦层析。多元缓冲液交换剂是一种交换凝胶，适用作普通聚焦层析的介质。各种凝胶性质见表16-8。

表16-8　聚焦层析技术数据

　　NONOP可制成两种高效液相柱：MONOp HR5/5(1ml)，和MONOp HR5/20(5ml)。使用时根据样品复杂性选择相应的柱。HR5/5分辨率为pI>0.2，HR5/20pI>0.02。

　　多元缓冲液交换剂PBE，属珠状交换剂凝胶，有PBe 118（pH11-8）和PBE（pH9-4）。在聚焦层析时，通过使用不同的洗脱液，可使交换容量发生改变，并且使pH达到更广的范围。