1. cDNA第一链的合成

1.1 取一个0.2 ml 薄壁管，于冰浴上加入：

混匀，短暂离心收集液滴至管底。

1.2 72°C温育2分钟后，冰浴2分钟并短暂离心收集液滴至管底。

1.3 在管中冰浴按下列顺序加入：

混合后离心5 秒钟，置冰上备用。

1.4 GeneAmp 2400 PCR仪上42°C温育1小时。

注：若使用水浴进行温育，应在反应混合物上覆盖一滴石蜡油以防止水分蒸发。

1.5 取出管子置于冰浴上中止反应。若不进行下一步，则将产物冻存于-20°C。

2. LD PCR扩增cDNA双链

2.1于冰浴上在0.2ml薄壁管中加入：

混匀后，短暂离心收集液滴至管底。根据表1的数据确定PCR循环数。

2.2 GeneAmp 2400 PCR仪上进行PCR反应，参数为：

· 95°C 1min

· 22次循环： 95°C 15sec

              68°C 5min

3. 双链cDNA补平反应

3.1 每50μl扩增好的双链cDNA加2μl浓度为20μg/μl的蛋白酶K，混匀后45°C温育1小时，短暂离心后置于90°C，10分钟以灭活蛋白酶K。

3.2 将离心管冰浴2分钟，加入3μl（15 units）T4 DNA聚合酶，16°C反应30分钟。

3.3 72°C，10分钟灭活酶，加入27.5μl，4 mol/L醋酸铵，再加入210 μl 95％的乙醇，颠倒管子数次混匀溶液。

3.4 立即于室温，14,000 rpm条件下离心20分钟（离心前不要将管子置于冰浴，否则会有杂质的共沉淀）。小心弃上清，用80％乙醇洗涤沉淀一次。

3.5 室温干燥沉淀，用19μl水重溶。

4. 接头与cDNA的连接

4.1 在3中第5步得到的重悬液中加入：

混匀后，短暂离心收集液滴至管底。16°C连接过夜。

4.2 加入3μl，0.2mol/L EDTA中止反应。

4.3 加70μl灭菌ddH2O,再加100μl酚-氯仿-异戊醇（25:24:1），轻轻颠倒管子约2分钟混匀液体，14,000 rpm离心10分钟分相。

4.4 小心取上清至一干净的离心管中，弃界面与下相。用酚-氯仿-异戊醇（25:24:1）重复抽提一次。

4.5 加入10 μl，3mol/L醋酸钠（pH 4.8）和250μl，-20°C预冷的95％乙醇，混匀后-20°C,沉淀1小时。

4.6 14,000 rpm，离心20分钟，小心吸弃所有上清。室温干燥10分钟，用30μl灭菌,ddH2O重溶。

5. Not I酶消化

5.1 在上述PCR产物中加入10 μl NE Buffer 3( New England Biolabs)，1μl BSA（10 mg/ml）, 8 μl （10U/ μl）Not I ，加水补足体积至100 μl，37°C酶切2小时。

5.2 酶切产物用Qiagen PCR产物纯化试剂盒进行纯化：在一个1.5 μl离心管中加入5倍酶切体积的缓冲液PB，混匀后加入纯化柱，将纯化柱套在一个收集管内，13 krpm、1 min离心，取出纯化柱，倒去收集管内液体，用750 μl缓冲液PE洗柱一次，13 krpm、1 min离心后倒出收集管内的全部液体，将纯化柱套入收集管内，再次13 krpm、1 min离心，然后将纯化柱套入一个1.5 μl 离心管中，向纯化柱内加入50 μl缓冲液EB，13 krpm、1 min离心回收纯化cDNA。加1μl 1％的二甲苯青做指示剂，置冰上待用。

6. cDNA的分级分离(采用试剂盒提供的分级分离柱)

6.1 准备16个1.5ml的离心管，依次做好标记。

6.2 准备cDNA分级分离柱，具体如下：

a．移去柱中的气泡。首先将柱倒置，移去底盖，用一长枪头或针尖伸入柱内轻轻吸去气泡，应避免用力吹打，否则会产生负压。气泡清除后应盖上底盖。

b．将柱正置，垂直固定好后，极缓慢的移去顶盖，再移去底盖，让柱内的贮存液流出柱体，流速应为每60-100秒一滴。

6.3 贮存液停止流动后，加700μl 1×colume buffer洗柱。

6.4 再加700μl 1×colume buffer洗柱。

6.5 小心且垂直的将30μl cDNA与二甲苯青的混合物加到柱床表面，让样品完全吸收进柱床，柱床表面不应再有液体。

6.6 用70μl 1×colume buffer洗装过cDNA的管子，并将这70μl液体上柱。

6.7 柱内液体不再流出后，加100μl 1×colume buffer，让液体自然流出，当柱床表面不再有液体时再加入600μl 1×colume buffer，此时二甲苯青应在柱内前进约几个毫米。

6.8 立即将编号为1的管子置于柱下开始收集液滴，依次收集16管，每管一滴，约35μl。 若第一滴的体积不足20μl，cDNA的洗脱峰将后移。

6.9 在1.1%的琼脂糖凝胶上检测分级分离效果，每管取3μl电泳。100V下电泳5 分钟。cDNA主要的洗脱应集中在6-11管，第8，9管cDNA含量最高，如此，则合并6-11的cDNA产物。若最亮的带不在第8，9管，则合并含最亮带及其前后各两管的cDNA产物。

6.10 并好的cDNA产物（约210μl）中加入：

混匀，-20°C沉淀过夜。

6.11 14,000rpm，20分钟离心，小心吸去所有上清，室温干燥10分钟，用适量的水重溶