核酸检测技术在常州地区献血筛查中的应用

何亚琴，张建伟，杨爱龙，濮云峰，庄华（江苏省常州市中心血站，江苏常州213003）

【摘要】目的：将核酸检测技术（Nucleic Acid Technology, NAT）应用于献血者血液筛查。

方法：采用罗氏诊断cobas s 201系统对2010年4月至2011年3月的血站常规EIA检测合格献血者的53,041份标本进行HIV、HCV和HBV三项联合筛查，并对NAT筛查阳性的标本做确证试验。

结果：53,041份血液标本中，经过血清学检测，HBsAg、抗HCV、抗HIV ELISA检测均为阴性的合格血液共51,991份。其中，NAT共检出阳性53例，阳性检出率为0.1%，分项确证实验怀疑其中一例血液样本处于HIV病毒“窗口期”，追踪检测证实其HIV呈阳性。

结论：NAT系统应用于献血者血液筛查有助于减少输血性艾滋病病毒（HIV）、乙肝病毒（HBV）和丙肝病毒（HCV）等感染情况，提高血液及输血安全。

【关键词】核酸检测（NAT）；HIV；HBV；HCV ；血液筛查；血液安全

HBV、HCV和HIV的输血传播一直是国内外输血安全领域最关注的热点之一。虽然通过对血液进行输血相关病毒的抗原或抗体的检测，使输血传播疾病的发生率明显降低，但输血传播疾病仍时有发生^[1]。其中，90%以上HBV和HIV的传播风险及75%以上HCV的传播风险来自于“窗口期”病毒感染^[2]。现有的血清学方法(ELISA)还不能检测出处于血清转换前的“窗口期”病毒感染。而近年来发展的高度敏感、特异的核酸扩增技术——NAT技术可以将HBV、HCV和HIV病毒的检测“窗口期”明显缩短^[3]，减少病毒经输血传播发生率，大大提高了输血和血液制品的安全。目前这项技术已在世界上许多国家和地区广泛使用。为进一步保证输血安全，提高血液质量，本站作为卫生部指定首批15所核酸检测试点采供血机构之一，自2010年4月开始对采集的无偿献血者血液进行HBV、HCV和HIV的核酸检测(NAT)，现报告如下。

1　材料与方法

1.1 标本来源与处理 

2010年4月-2011年3月本站共收集无偿献血者标本53,041份。所有固定捐血点配备水平离心机，采血结束后立即由采血人员完成对每位献血者4管标本的留取：分离胶促凝真空采血管（1管5ml ）用于酶免四项、ALT检测；带分离胶EDTA-K2抗凝真空采血管（1管5ml、1管8ml）用于核酸检测；EDTA-K2抗凝真空采血管（1管5ml ）用于血型检测；同时记录采集日期、样品编码等信息。所有标本均在2小时内经过离心后保存于2~8℃的冰箱。流动采血点在2~3小时内取回站部，全天至少三次，与检测中心交接后离心保存，在24小时内进行血清学筛查和NAT检测。

1.2 仪器 

NAT检测系统采用罗氏诊断 cobas s 201全自动核酸提取、扩增检测系统：HamiltonSTAR全自动混样仪、COBAS Ampilprep核酸提取仪及COBAS Taqmen Analyzer核酸扩增检测仪。Freedom evoclinical全自动加样仪(TECAN)；FAME酶免分析仪；低速离心机（KCD）；M PR 1410R冰箱（SANYOLABCOOL）。

1.3 试剂 

HbsAg  ELISA检测试剂、抗HCV ELISA检测试剂、抗HIV-1/2 ELISA检测试剂（国产试剂）。HBV、HCV和HIV核酸的提取试剂和检测试剂均为罗氏诊断公司的产品。

1.4 检测流程 

当日完成二遍ELISA（国产试剂）检测，次日上午NAT检测和ELISA复查同时进行。酶免阴性、单阳复查标本随机混合后用NAT法检测，酶免双阳标本做单标本检测。

1.5标本混合(Pooling)和检测：

每个一级混样池(pool)包含6个无偿献血者标本，每个标本取167 ul血浆至一级混样池，全自动混样仪加样。一级混样池标本采用COBAS Taqsceen MPX 检测试剂，在全自动核酸提取仪中应用MGP磁珠分离技术提取核酸，核酸扩增检测仪扩增检测HBV、HCV、HIV靶序列，在PDM服务器（罗氏诊断cobas s 201系统自带的服务器）中自动判读结果。每组检测均设置质控对照（HBV/HCV/HIV-1-O/HIV-1-M/HIV 2）。每个一级混样池均含内对照（internal control, IC）。阳性一级混样池拆分为6个组，组成该一级混样池的原始标本做单标本检测，单标本检测阳性判定为NAT阳性，单标本检测阴性判定为NAT阴性。

1.6NAT阳性标本的确证 

将NAT检测显示阳性的标本送至卫生部临检中心作HBV DNA、HCV RNA和HIV RNA的分项确证。

2 结果

2.1 血清学检测结果 

53,041份血液标本中，经血清学检测，HBsAg、抗HCV、抗HIV ELISA检测均为阴性的合格血液共51,991份。

2.2 核酸检测结果

对血清学检测为阴性的51,991份合格血液进行核酸检测，有53例核酸检测阳性( 罗氏诊断血筛试剂是HIV、HCV和HBV 3项联合检测，尚不能区分具体项目)。

其中1例混检三联检测HBV/HCV/HIV核酸，CT值为31.6，拆分三联检测HBV/HCV/HIV核酸，CT值为28.5；血站传染因子HBsAg、anti-HCV、anti-HIV、TP均为阴性；送卫生部临检中心确认HIVRNA可疑。

2.3 确认试验

将53份核酸检测阳性标本送至卫生部临检中心确认，其中9例为HBV/HCV/HIV阴性，43例HBV DNA 阳性，  2例  HCV RNA及HBV DNA阳性，1例  HIV RNA阳性（两对半检测结果见表一）。

2.4 追踪研究结果 

对上述一名怀疑感染HIV的献血者，在献血后第20天和第35天用样本的再次混样模式三联合检测HBV、HCV、HIV核酸，CT值为21.1，ELISA检测发现HIV二次检测转阳、梅毒也转阳。

根据WB 确证试验的结果，该献血者献血日标本，无带型，为阴性；献血后第20天标本带型为gp160  p24；第35天标本带型为gp160  gp120 p66 p55 gp41  p31  p24  p17，为HIV-1抗体阳性，证实为HIV感染者。

3 讨论

目前应用于血液筛查的NAT技术主要有Gen-Probe/Chiron公司的转录依赖扩增技术(TMA)和罗氏诊断公司的COBAS  Taqman方法^[4,5]。笔者采用COBAS  Taqman方法，从51,991份ELISA检测合格的血液中采取6标本混样法，并对阳性混样池进行拆分检测。共检测出53份NAT阳性血液，经分项确证试验鉴别，怀疑其中1例为HIV阳性，提示处于感染的早期（窗口期）。对这名怀疑感染HIV的献血者于献血后20天和35天分别进行追踪检测，其HIV再次检测转阳、梅毒也转阳。本站因而成功阻止了一例带有艾滋病毒的血液制品流向医院。此外，根据9例HBV阳性（含1例HBV/HCV混合阳性）样本的跟踪实验，有3例病毒含量升高，4例降低，2例大体持平，表明COBAS  Taqman方法可检出处于窗口期不同阶段的乙肝病毒（表二）。更为重要的是病毒载量试验检出了15例病毒浓度小于12 IU/ml的乙肝样本（表一），而这15例样本最初是由6混样法检出的。这证明COBAS  Taqman  6混样法的临床灵敏度远高于其分析灵敏度（3.8X6  IU/ml）。此发现也为泰国2009年48万人份的核酸检测试验所证明^[7]。此外，中国药品生物制品检定所在2010年的研究也发现，COBAS  Taqman 也能检出含量较低的核酸（1份样品HIV-1 RNA为<40cp/ml, 3份样品HBV DNA为<12cp/ml）^[8]。这些研究都证明COBAS  Taqman 6混样法的临床灵敏度远高于其分析灵敏度。同时，用COBAS  Taqman  6混样法，我们也检测出了2例HCV/HBV混合感染样本（0.003%）（表一），这个比例也高于中国人群中的HCV感染比例。这再次证明了COBAS  Taqman  6混样法的临床灵敏度是非常可靠的。

作为一种新型的筛查输血传播传染病因子的检测方法，NAT技术自1993年起已先后被欧美、日本以及我国香港等近20个国家和地区用来做献血者血液筛查。目前，输血安全面临的主要风险之一就是被筛查病毒的“窗口期”；研究表明，通过NAT检测，可将输血传播HBV、HCV和HIV的酶联免疫检测“窗口期”分别由原来的50、72和22 天^[6]缩短25、59和11天^[9]。

目前，常州城区年供红细胞12.6吨，人均用血量高达5.6毫升，居江苏省第一，并高于上海市的5.4毫升。从本站对常州市无偿献血者血液标本做的NAT试验结果看，现行ELISA筛查模式对于HIV仍具有一定的输血残余风险，而NAT技术更为敏感，可以筛查出尚属于感染“窗口期”的样本。也有研究者认为，从检测靶物质分析，ELISA指向抗原/抗体，NAT指向HIV/HCV RNA和HBV DNA，目前还没有证据明确显示病毒感染初期病毒RNA有效增值时间与抗原/抗体出现时间之间的关系，故认为两种方法的检测结果有互补之效，而不是简单的重复。

综上所述，NAT技术用于献血者血液筛查可以提高输血安全系数，保护献血者资源，保证用血安全，降低输血所引发的疾病传播的可能性。

表一  病毒载量实验及乙肝两对半结果

表二  阳性献血者跟踪病毒载量实验及乙肝两对半结果

参考文献

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[ 9] Meng Q, Wong C, Rangachari A,et al. Automated Multiplex Assay System for Simultaneous Detection of Hepatitis B Virus DNA, Hepatitis C Virus RNA, and Human Immunodeficiency Virus Type 1 RNA. J. Clin. Microbiol, 2001, 39: 2937 - 2945.