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脑片膜片钳实验方法(2)

时间:2005-05-25 09:12来源:本站原创 作者:bioguider 阅读:

自发性突触活动的发放频率通常小于几Hz。发育期标本上,自发性突触活动的频率就非常低(Edwards, 1990),因此,需要记录较长时间才能获得足够用于分析的突触反应。如果自发性突触反应的频率很高,多个突触的反应就会重叠在一起,就不能通过上升或下降支的时间来判断是单个突触反应或是多个突触反应的叠加,从而,给数据分析带来许多麻烦。突触反应的频率受温度的影响较大(Fatt, 1952),因此,在特定的实验中,可以通过调节灌流液的温度来调整合适的突触反应频率。局部施加去极化或超极化溶液也可以诱发自发突触活动(Bekkers, 1992; Tang, 1994)。在一些标本中,在刺激诱发的突触反应之后,自发性突触反应的频率会显著增高,在含有锶的灌流液中尤其如此(Dodge, 1969; Goda, 1994)。这一事实可用于检测与特定突触活动相关的量子大小(Otis, 1996)。

数据采集  突触反应可用计算机软件通过特定的采集卡采集到计算机硬盘上。记录电刺激的突触活动时,还须用计算机产生一个TTL脉冲以激活刺激器,并由隔离器经刺激电极刺激突触前纤维。

所需的数据量  电刺激所诱导的突触信号的记录中,其数据量取决于信噪比和信号的变异度。对电刺激诱导的全细胞电流记录而言,高信噪比不是问题,但在记录自发突触信号时,信噪比就变得比较重要了。实验前最好做预实验,估计获得准确的均数所需记录的信号数。当然,也应了解给定的刺激频率下突触信号的稳定性。对于电刺激诱导的突触信号,其峰值的变异系数较小,因此,以0.1Hz的刺激频率记录5~10次就足够了。对于自发性突触信号来说,信号峰值的变异度较大,通常大于20%,为得到较可靠的结果往往需要记录100个以上的信号。实际上,要得出准确的变异,往往需要记录成百上千次信号,这也是得到较可靠的信号峰值分布规律的必要条件。在低频刺激下记录突触信号时,要控制系统误差,使记录保持稳定,须要制备活性较好的标本,并要有配套的稳定的实验条件。精确的测量控制是保证实验数据可靠性的基础,而且,每次实验都要对其进行严格的评价。

6、突触反应的分析

(1) 刺激诱发的突触反应的分析

突触反应的大小和形状  突触电流和电位的检测指标有潜伏时(latency)、峰值(amplitude)、10~90%上升时间(10~90% rise time)、1/2峰值时的波宽(half width)、失活的指数拟合时间常数(exponential decay curve)(图1)。潜伏时是刺激尾迹(stimulus artifact)的起始时间到突触电流或电位峰值的5%间的时间间隔(Zhang, 1994a),潜伏时包括几部分的延迟:突触前轴突发放和传播动作电位的时间、神经末梢去极化到递质释放的突触延迟、递质扩散到突触后并引起受体激活的时间。由于递质扩散和受体激活的速度相当快,因此,突触延迟是突触前神经末梢发放动作电位和出现突触后反应间的时间间隔(Isaacson, 1995; Katz, 1965; Zhang, 1994a)。

突触反应的幅度是其峰值与反应前基线间的差值。信噪比较低时,须要计算突触反应前多个点和突触反应峰值前后多个点的均值,然后,以它们间的差值作为突触反应的幅度。上升时间用从峰值的10%到90%的时间描述较为准确。由于潜伏时的存在,很难判断突触反应开始的时间和到达峰值的时间。当刺激尾迹严重地干扰了突触反应起始的判断时,也可以用20~80%上升段的时间来描述上升时间。突触反应时程可以用以下几种方法来描述:1、1/2峰值间的时间,它包括了上升时间和下降时间;2、突触反应的下降支经多种指数拟合(如单指数拟合、双指数拟合和多指数拟合)产生一个或多个时间常数(decay time constant)。

 
图1 电刺激诱发的突触反应的定量分析


图2自发突触反应的分析。A将膜电位钳制于-70 mV时记录的微小兴奋性突触后电流;B 多个微小兴奋性突触后电流升支相重合的叠加图及其波幅的直方图。

双脉冲易化(paired pulse facilitation, PPF),即以较短的间隔重复刺激突触前纤维两次,第二次刺激诱发的突触反应大于第一次刺激的现象,这是一种突触前现象,它可反映突触前递质释放概率的变化。

最小刺激诱发的突触反应  记录最小刺激(仅能激活一个或少数几个突触前纤维的刺激)诱发的突触反应可用于估计量子的大小,这种刺激有时可以诱发突触反应(success),而有时则不能(failure),其诱导出的突触反应的均值可用于估计单个量子的大小。

可分析电刺激诱发的突触反应的软件  有许多常规软件均可用于突触反应的分析,如Axon公司开发的pClAMP软件包,WaveMetrics公司开发的Igor Pro等,均可用于电刺激诱发的突触反应的分析。

(2) 自发性突触反应的分析 

突触反应的检测  目前有三种方法判断自发性突触反应(Hwang,1999)。第一、峰值超过即定阈值,该方法受基线波动的影响较大,这可以通过基线加以弥补;第二、峰值相对于基线的变化量超过阈值,它受高频噪声的干扰较大,而且,很难设定一个合适的阈值,为克服这些不足,可以在处理时对原始数据进行滤波处理,除去高频噪声;第三、与即定的波形模板进行比较,然后,判断是否突触反应,该方法对符合模板的突触反应具有很高的敏感性,但在设定模板前,必须知道所要研究的突触反应的一系列参数的范围,如果模板设计不合理,将大大降低探测的敏感性,而且这种方式尤其不适于有信号重叠或多个突触成份数据的分析。

PCLAMP 9.0对自发突触反应的分析基于波形模板,只要模板设计得当,探测概率也较高。另外,Copenhagen等用Igor Pro开发了一个分析程序minifit.ipf。该程序对第二种方法做了一些改进,分三步探测突触反应。第一步,粗筛可能的突触反应,包括它们的起始时间和峰值时间;第二步,用突触反应起始与峰值间的差值计算可能的突触反应的波幅,去除波幅小于阈值的波形;第三步,对起始点之前数点和峰值时间后的多个点取平均值,以排除噪声的影响,并计算两者间的差值对突触反应的峰值做更精确的估计,如果该波幅低于阈值,与会从数据库中被删除。除波幅阈值的判断标准外,该程序还还引入了上升时间、下降时间和波形时程范围等描述波形模板的参数来进一步判断突触反应。该程序还可用于测量突触反应的生物物理学特征。它可计算10~90%上升时间,描述突触反应的上升相的动力学。该程序调用了Levenberg-Marquardt非线性曲线拟合函数对突触反应的下降相做单指数或双指数拟合,通过双指数拟合与单指数拟合的比较检验,计算其失活时间常数。该程序还提供了一个非常有用的功能,就是将所有记录到的非连续的突触反应以上升支的中点为基础相叠加,做逐点平均,这样,既可以降低噪声,也可以计算其动力学特征参数。

总之,脑片膜片钳记录成功的前提是制备活性较好的脑片,记录条件优化后,实验的稳定性、可重复性和准确性均较高,在神经科学领域应用较为广泛。许多神经毒物可影响中枢神经系统的突触传递功能,脑片膜片钳技术将为实时、准确、高效地研究这些毒物作用的机制提供可靠的技术支持。

(责任编辑:泉水)
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