实验室诊断

1、血象：白细胞数显著增高，最高可达40×109/L，中性粒细胞在80%~90%以上。
2、疑为流脑者应做腰椎穿刺检查，脑脊液压力常增高达1.96kPa以上；典型病例CSF的外观浑浊如米汤样甚或脓样；白细胞数增多，可达每升数亿，以多形核细胞为主；蛋白质显著增高，可达1~5g/L;糖量常低于2.22mmol/L，氯化物也稍降低。CSF涂片可在中性粒细胞找到革兰氏阴性双球菌。
3、从病人CSF或急性期血液分离到Nm。
4、从病人急性期血清或尿或CSF中检测到Nm群特异性多糖抗原。
5、检测病人恢复期血清抗体效价较急性期呈现4或4倍以上升高。
6、以PCR检测到病人急性期血或 CSF中Nm 的DNA特异片段。

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 流脑病原学检查方法
1、标本采集
㈠、脑脊液(CSF)：如果怀疑为脑膜炎，CSF是用于分离和鉴定病原体最好的标本。取患者CSF2-3ml ，注入无菌的试管内。3000转/分，离心20分钟，用无菌吸管取沉淀物直接接种到10%羊血巧克力色琼脂平皿上做细菌培养。CSF沉渣还可涂片，作革兰氏染色镜检。CSF离心后的上清液可置-20℃，供做血清学检查Nm群特异性抗原。
㈡、血液：在疾病早期，病人高热时采取静脉血6ml ，往盛有30ml 葡萄糖肉汤的三角瓶内注入4ml血做增菌培养。（也可用市售的双相血培养瓶）留2ml血注入无菌试管内分离血清，做血清学检查Nm特异抗原和急性期抗体。在病人病后1-2周采取第二次血液2ml ，注入无菌试管内分离血清，检查病人恢复期抗体。若恢复期抗体的滴度比急性期升高4倍或4倍以上，具有追溯诊断的意义。
㈢、出血点渗出液：选择新出现的皮疹，以75%酒精消毒局部皮肤，用无菌针头挑破淤点或淤斑，轻轻地挤出组织液。用无菌毛吸管吸取渗出液直接接种到巧克力色琼脂平皿上做分离培养，也可将渗出液涂片，作革兰氏染色镜检。渗出液还可以先接种到含双抗的兔血清肉汤中增菌后再分离、培养。 ㈣、鼻咽拭子：对健康人群或病人密切接触者进行带菌检验时一般采咽拭子。咽拭子直接接种到10%巧克力色双抗血琼脂平皿或卵黄双抗琼脂平皿上分离Nm。咽拭子也可以插入卵黄双抗液体培养基或双抗兔血清肉汤中37℃，5%CO2增菌后再分离。
2、Nm的分离与鉴定
（一） 脑膜炎双球菌为专性需氧菌，初次分离时需5~10%的二氧化碳环境才能生长，最适生长温度为37 ℃ 。
（二）传代培养：如在同一平板上有大量细菌生长，而且单个纯菌落很少或根本没有时，可再进行传代培养。分离出单个菌落进行其它检测。通过菌落的肉眼形态学特征来判定是否对细菌进一步研究。
(1) 用接种环挑出三个单个的可疑脑膜炎球菌的菌落。
(2) 用接种环对可疑菌的菌落划线接种到一个新的平板（血平板或巧克力平板）。
(3) 放烛缸或二氧化碳培养箱35-37 ℃孵育24小时。
（三）菌落：Nm接种于巧克力色琼脂平皿上，5%CO2，37℃ 培养24小时后，其菌落直径约1mm ，表面突起、光滑、湿润、圆整、略带灰白色、半透明、不溶血、无色素。培养时间延长，菌落增大、变成黄色、不透明、并可出现颗粒状中心和放射性周边。
（四）细菌形态：Nm应为革兰氏阴性，呈卵圆形和肾形，0.8×0.6大小。常成对排列，邻近两边扁平凹陷。（脑脊液涂片见图）
（五）生长及抗原特性：绝大多数Nm菌株分离葡萄糖和麦芽糖，产酸不产气。不分离蔗糖、果糖和乳糖。过氧化酶和氧化酶阳性。
　　方法：用接种针从培养过夜的血平板或巧克力平板上挑取一部分纯菌落，反复刺入培养基内几次，深度达10mm。每一种糖接种之间要将灭菌环灭菌。盖紧试管盖，放37 ℃培养箱内培养。作为阴性丢掉前至少要培养72h。如用酚红作指示剂，阳性反应则培养基的上部从红色变为黄色。（见下图）

　　氧化酶试验：可用市售的氧化酶试剂或新鲜配制的氧化酶试剂。用牙签挑取一部分待检菌落涂布到滤纸片上，再滴上试剂，如在10秒钟内出现紫色，即为阳性反应。
（六）血清分型鉴定：
（1）滴一滴诊断血清或盐水在清洁的玻片上。
（2）用白金耳刮取菌苔少许，在玻片上沾取少量血清，在一旁研磨均匀，再与血清混匀。
（3）检查从病人分离的疑似Nm时，先用A群和C群抗血清检测，如果是阴性反应，再用其它的抗血清，特别是B或W135型抗血清。
（4）摇动玻片1-2次，在亮光暗背景下观察结果。
（5）不与盐水发生凝集，与一种脑膜炎抗血清发生凝集反应，即为某一型的流脑菌。
（6）在盐水中发生凝集反应，不能作为抗血清分型（无荚膜多糖的细菌）。

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 流脑血清学检查方法

1、玻片凝集试验:应用玻片凝集试验对Nm病原菌株或带菌者菌株进行血清学分群。
　　Nm诊断血清：国产售品有多价Ⅰ（包含A、B、C、D群），多价Ⅱ [含1889（Y）、 1890（H）、1892（29E）]，多价Ⅲ[含319（W135）、1916（X）、1486（I）、1811（K）群]及各群单价血清，共计14种。（括号内为国际编码）
2、胶乳凝集试验应用胶乳凝集实验测定病人CSF、急性期血清和尿中Nm群特异抗原，辅助流脑临床诊断。可用市售的脑膜炎乳胶凝集试剂盒（如法国梅里埃公司的试剂盒）。方法：一滴乳胶试剂（30μl）加上一滴病人的脑脊液，涂匀，在2分钟内出现明显凝集者为阳性。
3、酶联免疫吸附试验（ELISA）：应用ELISA间接法测病人急性期和恢复期血清中抗A群流脑IgG的抗体水平。此方法也可以应用于健康者血清抗体的测定。若病人恢复期血清抗体效价较急性期呈现4或4倍以上升高有追溯诊断的意义。
4、PCR检测：应用PCR检查病人急性期血清或CSF中Nm的DNA特异片段，对流脑病人进行早期诊断。

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　菌种保存

1、短期保存：保存脑膜炎双球菌，使用市售的带有通气膜的螺盖试管斜面，因通气膜可进行气体交换，所以可保存14天。脑膜炎双球菌的斜面不能冷冻。或用卵黄盐水保存，可保存7天。
2、长期保存：最好方法是低温冷冻或冷冻干燥。所有的细菌都可在-70℃冰箱中冷冻保存。将脑膜炎双球菌接种在BAP或CAP中，放二氧化碳培养箱中35-37 ℃孵育18-20小时，收集细菌放到含1ml脱脂牛奶的2ml螺盖冷冻瓶中（外部螺口）。将菌苔在管壁研磨振荡，使细菌分散在培养基中。-70 ℃低温冰箱分类保存。

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 培养基制备

1、 巧克力色血液琼脂：
　　成份：营养琼脂（pH7.6） 100ml 
         脱纤维血 5~10ml
　　制法：将营养琼脂溶解，以无菌手续加入羊血，摇匀。置水浴锅内，维持在90℃20~30min。待培养基冷至50 ℃ 时才倾注平板。如做病人密切接触者或健康人群带菌调查时，则需加双抗，每1000ml培养基加入多粘菌素4.2mg（或2.5万单位），万古霉素3.3mg。
2、血清半固体糖发酵管
　　成份：牛肉膏 2.5g       NaCl     2.5g 
         蛋白胨 5g        琼脂粉     1.25g
           DW  500ml      2%酸性复红 2.5g
        正常兔血清   5ml
        葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、果糖和乳糖各0.5g
　　制法：
　　（1） 将牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂溶于400mlDW中，加热溶解，补水至500ml，矫正pH7.4-7.6。过滤后分装于5个200ml 容量的三角瓶中，每瓶100ml。
　　（2）分别称取上述5种糖各0.5g，加到上述5个三角瓶中，作好标记，再每瓶加入酸性复红0.5ml。
　　（3）将上述含糖培养基高压灭菌10磅15分钟。
　　（4）灭菌完毕，培养基冷至50℃ 时往各瓶加入灭活的兔血清1ml。无菌分装到小试管内（10×100 mm），每管约2ml，作好标记，无菌试验后备用。 说明：加入酸性复红后，培养基呈淡红色，当接种菌后，产酸，培养基即呈深红色。若用酚红做指示剂，则接种菌后，培养基由红色变为黄色（上部）。
3、卵黄盐水：
　　将新鲜鸡蛋洗净，在70%酒精中浸泡消毒1h后取出，用3%碘酒消毒蛋壳，以无菌操作于鸡蛋的一端开一小孔，使蛋清全部流尽，蛋黄倒入置有玻璃珠的三个烧瓶中，打碎后，一份蛋黄加一份生理盐水，再在摇珠瓶中振摇，使其混匀呈乳状分装试管，56 ℃ 加温30 min ，置37 ℃ 作无菌试验。（脑膜炎双球菌保菌用）
4、增菌肉汤：
　　成份：新鲜牛肉汤 100ml 葡萄糖 0.5g
　　配制： 混合上述成份，调pH至7.4~7.6分装试管，2ml/管或30ml/瓶，高压灭菌10磅10分钟，无菌检验合格后供增菌用。
5、 脱脂牛奶的制备：
　　将新鲜牛奶（不含糖）煮沸，冷却后，置4℃冰箱过夜，次日再离心30分钟，每分钟3000-4000转，除去上层脂肪后，分装小试管和小瓶。以10磅高压灭菌15分钟，置4℃冰箱备用。

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 诊断试剂

1、诊断血清：可购自中国疾病预防控制中心传染病预防控制所呼吸道细菌室流脑组（北京昌平流字五号）或中国药品生物制品检定所（天坛西里2号）。
2、血平板或巧克力平板：自制或市售。
3、粘菌素或万古霉素：北京陆桥技术有限责任公司有售。
4、胶乳凝集试剂盒：法国梅里埃公司有乳胶凝集法脑膜炎检测试剂盒。（货号：58803），可测定A群、B群及C群流脑，所用材料为病人脑脊液。
5、奈瑟氏菌属生化鉴定管：广东环凯微生物科技有限公司有售。