蛋白的Western blot 检测标准操作规程

一、实验名称：蛋白的Western blot检测

二、实验目的：蛋白质的检测与分析

三、背景知识：Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。可以非常有效的鉴定某一蛋白质（或表位）的性质；结合免疫沉淀法，可以用来定量分析小分子抗原。2. 表位作图3. 结构域分析 4. 斑点印迹，可用层析组分，蔗糖梯度或脉冲追踪实验分析5. 功能实验中蛋白质复性6. 配基结合，免疫印迹后多种配基可同蛋白质进行配基结合试验。7. 抗体纯化8. 有膜上收获蛋白质条带制备抗体9. 氨基酸组成分析和序列分析，极微量蛋白质（10pmol）转移到PVDF膜上或可进行氨基酸组成分析和序列分析。转移的蛋白质或多肽条带可经考马斯亮蓝染色后切下进行氨基酸组成分析或序列分析。

四、基本原理：与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

五、药品和试剂：检测试剂盒包括1）30%丙烯酰胺/0.8% N,N’-亚甲丙烯酰胺；2）4×Tris•Cl/SDS； 3）4×Tris•Cl/SDS, pH6.8；4）4×SDS电泳缓冲液；5）TEMED； 6）10%过硫酸铵；2.抗体试剂盒

六、仪器设备与材料：快速筛选型电泳系统（美国伯乐公司），包括：mini-protean4，PowerPac HC高电流电泳仪，SD 半干转印槽

七、实验对象：人动物组织、细胞

八、实验环境：室温

九、操作步骤：1）按厂商的使用指南用两块干净的玻璃，平板和0.75mm垫片组装电泳装置中的玻璃平板夹层，并固定在灌胶支架上。
2）按表7.1配制分离胶液体并脱气，然后加入10％的过硫酸铵和TEMED，轻轻搅拌混匀。
3）用一根巴斯德吸管立即将分离胶液体沿夹层中一条垫片的边缘加入于玻璃平板夹层中，至凝胶约5cm高为止。样品体积少于10μl不需灌制积层胶。
4）用另一根已斯德吸管，先从一边的垫片，再从另一边垫片往夹层的液面顶部缓缓加入一层水饱和异丁醇（厚约1cm）。让凝胶在室温聚合30min
聚合后，可见在顶层异丁醇与凝胶的界面间有一清晰的折光线，胶的聚合失败往往问题在于过硫酸按或TEMED，或两者都有。
5)倾去顶层的异丁醇，并以1×Tris-Cl/SDS, pH8.8缓冲液冲洗凝胶的顶部表面,尽量用吸水纸吸干。
6)配制积层胶液体，用吸管将液体沿一条垫片加入到玻璃平板夹层，直至夹层的顶部。
7)将0.75mm厚的梳子插入夹层的积层胶液体中，必要时，再补加积层胶液体充盈剩余空间。让积层胶室温聚合30min。
8)在具螺口盖的微量离心管中，用2×SDS加样缓冲液按1:1(v/v)稀释待测蛋白质样品，于100℃煮沸5-10min。如样品是蛋白质沉淀物，加入50～100µl 1×SDS加样缓冲液溶解之，并同样在100℃煮沸5-10min。用2×SDS加样缓冲液溶解蛋白质分子量标准混合物。
9）小心拔出梳子，避免撕裂聚丙烯酰胺凝胶加样孔。取出梳子后，以1×SDS电泳电泳缓冲液冲洗加祥孔，并以此缓冲液充满之。
10）将凝胶板固定到电泳装置的上缓冲液室（上槽），同时往下缓冲液室（下槽）加入推荐量的1×SDS电泳缓冲液。
11）将固定于上槽的凝胶板放入下槽中，并往上槽加入部分电泳缓冲液至刚好淹没凝胶的加样孔。
12）用带平嘴针头的50µl注射器将同样浓度的蛋白质样品等体积加入到样品孔中，小心加样使样品在孔的底部成一薄层，对照孔加入蛋白质分子量标准样品，如有空置的加样孔，须加等体积的空白1×SDS样品缓冲液，以防相邻泳道样品的扩散。
13)再往上槽加入余下的1×SDS电泳缓冲液。此操作缓慢小心，以防冲起样品孔中的样品。
14）连接电源，对于0.75mm厚的垂直板电泳，先在60V下电泳至溴酚蓝染料从积层胶进入分离胶，再将电压调至120V继续电泳至溴酚蓝到达凝胶底为止。                                  

15）关闭电源并撤去连接的导线，弃去电泳缓冲液。连同上槽一起将凝胶夹层取出。
16）将凝胶定位以便识别加样的顺序，将凝胶板从上槽解离出来，放在一叠吸水纸或纸巾上。                                         

   17）小心将封边的垫片抽出一半，并以此为杠杆橇起上面的玻璃平板，使凝胶暴露出来。
18）小心从下面的玻璃平板上移出凝胶，在凝胶的一角切去一小块以便在染色及干胶后仍能认出加样次序，接着就可进行蛋白质的检测。             19)转膜：将凝胶面与负极相连，硝酸纤维素膜与正极相连。（100V，1小时）要放于4℃。小心：丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收，其作用具有累积性。称量丙烯酰胺和N,N’-亚甲丙烯酰胺时应戴手套和面具。可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能含有少量未聚合材料。由于过硫酸铵会缓慢分解，故应隔周新鲜配制。                    

   20)清洗：将硝酸纤维素膜放入1X TBST中清洗3次，每次5分钟。摇床摇动。
21)封闭
22)一抗孵育：一抗用TBST1:1000稀释，将硝酸纤维素膜放入其中，37℃孵育1.5小时，(或4℃过夜)摇床摇动。                          

   23)清洗：将硝酸纤维素膜放入1X TBST中清洗3次，每次5分钟。
24)二抗孵育：二抗用TBST1:8000稀释，将硝酸纤维素膜放入其中，37℃孵育1小时，摇床摇动。
25)清洗：同23）之后，用1X TBS在清洗2次，每次5分钟，以洗去膜上的Tween 20，因为它可以阻碍底物的沉积。
26)显色： 1mL水+1滴（大约50微升）试剂A(之后混匀)+1滴试剂B+1滴试剂C，硝酸纤维素膜放入其中孵育，一旦显色，立即放入去离子水中终止反应。

十、实验结果评价：化学发光法检测，膜与化学发光底物孵育，经X胶片曝光显影。图片扫描保存为电脑文件，并用GIS1000分析软件将图片上每个特异条带灰度值的数字化。数据分析：目的蛋白的灰度值除以内参GAPDF的灰度值  以校正误差，所得结果代表某样品的目的蛋白相对含量。

十一、注意事项：丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收，其作用具有累积性。称量丙烯酰胺和N,N’-亚甲丙烯酰胺时应戴手套和面具。可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能含有少量未聚合材料，由于过硫酸铵会缓慢分解，故应隔周新鲜配制。