【膜片钳】膜片钳讨论区资源整理

为了从讨论区的信息中取其精华，版主会每星期将讨论区有价值的帖子整理出来，方便大家的学习，其他战友请勿跟帖。Q：weik2008
那么我就来提第一个问题。
我是一名新手，记录到一些电流，但不知道是不是leak current。
所以我想问：
1、用epc放大器和pulse软件怎么确认leak current？
2、如果有leak current，怎么来减漏？

A：xiaoxuanzi

你可以根据图中标记的电流、封接电阻的大小及你protocal中钳制电压的 大小来判断漏电流的情况
具体示图见artate
110, KCl 20, MgCl2 7.0, CaCl2 0.69, K2-ATP 5, Na2-GTP 0.1, creatine
phosphate-K2 5, EGTA 5, and Hepes 5 (pH 7.4 with KOH) (mmol/
L). According to the stabilizing constants proposed by Fabiato and
Fabiato [18], with the correction of Tsien and Rink [19], the pCa of the
internal solution was calculated to be 8.0.

Tyrode’s solution, used for cell isolation and the recording of action
potentials, was composed of (in mmol/L) NaCl 143, KCl 5.4, MgCl2
0.5, NaH2PO4 0.25, HEPES 5.0, CaCl2 1.8, and glucose 5.6 (pH 7.35
adjusted with NaOH). The internal pipette solution was composed of
(in mmol/L) KOH 60, KCl 80, aspartate 40, HEPES 5.0, EGTA 10,
MgATP 5.0, sodium creatinine phosphate 5.0, and CaCl2 0.65 (pH
7.2 adjusted with NaOH; pCa 8.0).

A：xiaoxuanzi
pCa是反映自由钙离子浓度的指标，如果胞内自由钙离子浓度为10nmol(就是10-8mol)，那么pCa=8，同理，如果胞内自由钙离子浓度为100nmol(就是10-7mol)，那么pCa=7，象上述配方虽然加了CaCl2 0.69mmol,但他也加了钙离子鳌合剂EGTA，其实游离的钙浓度为很低的，pCa为8的说明只有10nmol(就是10-8mol)，加EGTA的目的是降低自由钙浓度，减少破膜后重新合上的概率，因为钙是膜重新合上的作用，另外胞内钙浓度很低可以阻断某些特定的电流。Q：zygrapewine
诸位高手。我是膜片钳的新手，在配制电极内液时，发现EGTA10mM在水中溶解不了，使用许多方法也不行，请问EGTA在水中是不溶解吗？如果不溶于水，应该如何配制电极内液呢？
期待紧急的回复，衷心感谢！！

A：xiaoxuanzi
EGTA是酸性的，加了EGTA后如果你 测一下内液PH值的话你会发现PH只有2-3左右，在这种条件下EGTA是很难溶的，你可以加KOH将PH调到6点多之后就很好溶了，最后再将PH调到7.2，当然具体加什么碱看具体的配方了，有的可能加CsOH或其他碱Q：anestiger
请教版主，我在做心肌细胞膜片钳时，电极一入液面就出现overload提示！浴池电极已由原来的铜线改为铂丝电极；玻璃电极拉制参数原来的很好，也未改动，电极液充灌液很好，不知为什吗一直是overload？期待回复，感谢

A：poneyy
以我所知，一般浴池电极都是用银丝或者铂丝，银丝需要定期电镀，使其表面形成更稳定的氯化银；而铂丝不用电镀，但是价格高。一直是overload，觉得有几个原因：1.电极入水时已断裂；2.增益太大，可以每次入电极之前Reset一下；3.电极开口拉制太大，玻璃电极拉制参数原来的很好，一定要再看看拉出的形状和开口，拉制仪的参数受温度和湿度影响，可以再测量一下，重新设定。

A：xiaoxuanzi
另外为了排除原因更全面的话，holder接上模拟细胞，如果还是出现overload，那说明是放大器的问题，如果没有，那说明是不是放大器的问题Q：akeyword
最近记Na电流，电流较大（5nA），因为要记激活与失活，所以必须要进行串联电阻补偿，所用放大器为Axon 200B，prediction 和 correction 补偿到至少80％。有一个问题想请教高手，就是关于lag的问题，lag可以保证补偿过程中电路的稳定性减少振荡，查阅相关资料，说如果补偿好后，lag应尽量小（我只能到10us，再小就振荡明显，细胞挂掉了），否则减小什么输出频率， 不懂是什么意思，望高手解答。还有就是我现在补偿80％后，lag20－30us对记录有没有影响？lag最大可以多少？

A：sfboy
correction补偿能够纠正电极的电压降和消除限制电流信号带宽的RsCm滤波器作用。由于correction是正反馈电路，correction值过大就会引起电路振荡。而此时lag即可用于保证电路的稳定性，以防止振荡的发生。最好在施行correction功能前，调节lag在10-20us处。但由于lag是通过限制correction电路的频带宽来达到防止振荡的目的，因此当correction值达到所需数值时，通常需要尽量减小lag值。当correction为90%时，lag一般为5us。

你的lag只能到10us，再小振荡明显容易细胞就挂掉了，说明你的correction补偿的不到位。

正常的补偿方法为：调节prediction到95%左右，调节lag到10us，调节correction到95%左右。此时，在命令脉冲电压的起止处将会出现一个较大的电流瞬变值，该瞬变值呈现逐渐减弱的变化，然后逐渐融入基线。

axon200B的串联电阻补偿很有味道，电容瞬变值的消除也需要方法和技巧，具体的细节还需要你自己的摸索。

祝实验顺利！Q：zygrapewine
我们实验室没人做过膜片钳，所以我这个虾米打算不耻下问，常驻于此了。再请教：盐桥可以用针管烧弯了做吗？应该用多大的针管？1ml？一个盐桥就够了吗？

A：baxiansheng
盐桥当然可以用针管烧弯了做，1 ml就足够，一个盐桥就够了。盐桥做法：琼脂糖粉末用3M KCl溶液搅拌，加热使其融化，冷却成凝胶状，填塞于一个两头通的U型弯管中。
一般盐桥的形式有两种，一是在浴池旁另开一个隔开的小池，里面放电极内液（对称整个电路）或3 MKCl溶液，将充灌了琼脂糖凝胶的弯管搭于小池和浴池之间，另将银-氯化银浴池电极置于小池中，就行。
另一种是用一个1 ml注射器抽吸配好的琼脂糖凝胶，抽吸时预先将银-氯化银浴池电极置于注射器内，这样银-氯化银浴池电极就和琼脂糖凝胶很好接触。注射器头弯曲后置于浴池就行。这种盐桥，一旦银-氯化银浴池电极的氯化银镀层消耗了，更换比较麻烦。Q：med2006
各位同道，我是刚接触膜片钳的，想记录兔心肌细胞ＩＫr电流，能告诉我电极内液，外液的配方吗？不胜感激！

A：baxiansheng
不知是全细胞还是贴附式的？一般细胞外液就用台氏液就行，如果全细胞电极内液需要高钾液。台氏液（mmol•L-1）：NaCl 135，KCl 5.4，MgCl2 1.0，NaH2PO4 0.33，CaCl2 1.8，HEPES 10， Glucose 10；用NaOH调pH至7.4。电极内液（mmol•L-1）：KCl 140，MgCl2 1.0，Na2-ATP 2.0，HEPES 5，EGTA 10；用KOH调pH至7.2。Q：mamao
请教如何根据一副电流图画出它的标尺来？我在clampfit中打开一个电流图，我把这个电流图拷贝到word准备写文章，可是那个标尺如何画？clampfit里面是否有专门的工具画这个？因为写毕业论文，请稍微详细一点我好照着学，非常感谢你的帮助

A：baxiansheng
目前我也没有发现clampfit有画标尺的。我是在clampfit里打开电流图形后，在“Edit-Copy”对话框里选择“copy data to clipboard as a Metafile using page Setup setting”，点确定后，在word里粘贴，图形就带有横坐标时间和纵坐标电流强度。如果想要投稿的标尺样式，可以拷到画图板里，比着坐标画一个标尺，然后用橡皮擦擦掉坐标。
另外，还可以将clampfit的电流图形导出数据，将这些数据导到Origin或CorelDraw中重新绘制，标尺也可以参照电流的数据，自己输入数据画出标尺图形。Q：zygrapewine
版主，我发现3M的kcl总是顺着盐桥产生结晶析出，而且顺着盐桥的另一端大量析出结晶，放在kcl 小池里的浴池电极上面银丝镀上的氧化层好像也很容易掉，这是怎么回事呢？
另外，我的玻璃电极用外径1.5mm内径0.86mm的拉成尖端1微米的电极，但是入水以后膜测试显示电阻值特别大出现↓↓↓，难道是尖端太粗了吗？
感谢及时回复！！

A：孙丽华
盐桥实验后需放回饱和KCL浸润，的确很容易析出，用过一段时间后琼脂回缩，或出现气泡，就要重新再做一条盐桥了。参比电极的Ag-AgCl作用已经可以由盐桥取代了。Q：anestiger
园子里的战友们,不知大家是否注意到,在分离大鼠心肌细胞时,如果在酶液中加入钙(75uM),分离过程中心脏容易出现区域性发白,结果分离的细胞往往不好,数量状态都不好.而如果不加钙时,很少发现心脏有区域性发白.大家是否有同感?究竟分离细胞时加钙还是不加钙?
另外还有啥注意的?
有没有用肝素抗凝,防止血栓?我们是心脏连同部分肺一起取出,放入低温台式液中修剪好后再挂到langedoff装置灌流分离.是否这种操作欠妥?好的操作过程是怎样的?

A：sfboy
酶液中加入钙，的确会出现你说的问题，但你可以将钙的量调小一些，不加钙时酶的激活不佳，同样分离效果不好！我们用腹腔注射麻醉或乙醚麻醉，分离时间快的话，没有必要用肝素抗凝，步骤很烦琐！Q：luckyfish 各位高手：
我做的是延迟整流性钾通道，我需要用延迟整流性钾通道的特异激动剂，可文献没见报道，只见延迟整流性钾通道的特异阻断剂，我该如何寻找呢？给我点建议吧，不胜感激！

A：baxiansheng
延迟整流性钾通道是电压依赖性通道，激活因素是膜电压的变化，当然没有特异的激动剂。你就用电压变化来激活它就可以，为什么还要找特异激动剂呢？Q：anestiger
另外请教：分离大鼠心肌细胞是有人在酶液中加BSA（白蛋白），不知效果如何？是否比不加BSA的酶液分离到的心肌细胞会好？园子里哪位大侠用过？怎样？
我先说说我的感觉：我用的是胶原酶2型，8－10mg/50ml酶液，分离灌注时间为18－22分钟，不管加不加BSA，刚分离下来时活细胞数量有70－80％，但形态不好，周缘不归整，模糊。过一会儿会死很多，所剩活细胞很少!根本没法做到膜片钳！BSA好像没什么作用！
准备好液体后麻醉大鼠，断颈动脉放血，开胸取心脏，迅速放入冷无钙台式液中修剪后挂到Langendorff上，结扎固定，用无钙台式液灌注冲洗8分钟，改为酶液 灌注16－18分钟，在此过程中通氧气。心脏变软后停酶液，取心室部置入KB液中剪碎，吹打，150目网过滤得到细胞。 由于加钙后，心肌就变白，后来就不加钙了。 即使这样，细胞也不好！
老师说，这个季节应该是细胞最好的，但到现在也没有好细胞可作！请各位大侠指点迷津，如何能分离到好细胞！好细胞，做梦都想她！

A：sfboy
BSA的作用是保护心肌细胞膜不受酶的损害，要想分离到比较好的心肌细胞，BSA是必须的！
酶液消化发白实际上有时候并不是消化好的标志，所以具体的时间还需要你自己摸索，我的建议是用孵育方法消化心肌细胞，这样得到细胞各个时间点均有，便于摸清消化的最佳时间！
加钙我的经验也是必须的，这样酶的激活会更好，你消化时间长与不加钙有关系，但是加钙的量同样需要摸索，加的量过大，分离的心肌细胞不耐钙！

A：poneyy
大鼠心肌细胞是比较难分的，每一步都很重要，要努力的排除你认为可能有问题的步骤。
1.酶量、浓度：一定要现用现配，称量准确，必要时按照其效价计算最终用量，因为酶的批次不同，效价都有差别。
2.氧气：一定要保证所有的液体都是氧饱和的，尤其是心脏分离和灌注过程中。“刚分离下来时活细胞数量有70－80％，但形态不好，周缘不归整，模糊。过一会儿会死很多，所剩活细胞很少!”针对你的情况，我以前也遇到过，很可能是心脏分离过程中缺氧太严重。
3. PH值和温度：现在实验室条件都很好，估计问题不大，但是PH计要做校正。
4. 细胞保护：分离细胞后要少震动，静置，加“BSA”作用是保护细胞，因为各种酶中都含有一定的杂质如姨酶，“BSA”保护细胞免受姨酶的破坏。
运气也是很重要的—玩笑， 祝好运。Q：zygrapewine
请教：
各位高手你们平时用的玻璃毛细管都是什么规格的，有那个厂家的比较好用能推荐一下？急用！
我平时用的是外径1.5mm内径0.86mm的硬质玻璃管，拉制尖端在1微米左右，入水阻抗4－6兆欧，现在厂家赠送的进口玻璃管用完了，不知道那里购买好，请求指点迷津！！！

A：baxiansheng
如果想要质量好的，当然还是进口的好，但是贵。这可以随便找一家膜片钳代理公司（比如拜谱、先仪谱、普升公司）一问就会提供你很多信息。
国内主要是华西医科大学仪器厂（联系人：吴经理1398006693），规格固定了，外径1.5-1.7mm，可以看出标准上差一些。但用起来还行。
南京六合泉水教学实验器材厂（联系025-7580642），规格可以按要求作，感觉不错。
还有上海科达公司，没用过。
国内的最好买有芯的，虽然贵些，但充灌电极内液不容易产生气泡Q：patchnnd
我要记录的是HERG电流（HEK 293细胞转染表达），为什么记下的电流往往都是step电流大于尾电流？在文献中看到的都是step电流整流以后，尾电流继续增大，尾电流大于前面的step电流。protocol是师兄设好的，我直接用了。
新手上路，请指点

A：baxiansheng
HERG电流就是Ikr电流，由其名字快速激活延迟整流钾电流可知，激活时间比较短，所以在设置protocol时，去极化时间不可太长。另外电流大小取决于通道电导和驱动电压的乘积，尾电流的驱动电压等于去极化方波回落的电压值与钾离子的翻转电位的差值，所以去极化方波回落的电压值不可太接近钾离子的翻转电位（-90mV）。所以你最好先看看仪器设置的protocol有没有问题，和文献是否一样。
另外一个就可能是转染细胞的问题了。Q：localbaby
谢谢ws9912
我还想请教一个问题
不知道版上有没有人做平滑肌细胞的
我现在尝试做培养的大鼠平滑肌细胞L－type Ca电流，但是细胞很不好封接，给负压后大多数情况下无法上升到30M，有些到300M就升不上去了
不知道做平滑肌细胞有没有什么特别之处要注意呢？
此外，我用的胞外液是KH液，有时也用标准胞外液
电极内液用的是测心肌Ca电流的电极内液，除了CsCl，没加任何阻断剂的
不知道这会不会有什么影响

A：baxiansheng
平滑肌细胞本身就很难封接成功，因为它个头比较小；培养的大鼠平滑肌细胞就更难，因为它缺乏立体感。可以试试封接前，先把细胞消化下来，悬浮在液体中，使其有些立体形状，然后静置，稍稍贴壁，就开始封接，而不是爬片那样扁扁的。
封接时要换用标准胞外液的，而不能是KB液，KB液中不含Ca2+，不利于封接。Q：med2006
请问分离兔的心肌细胞和大鼠的心肌细胞抬氏液的配方是否有区别，我们是分离兔的心室肌细胞，最近细胞贴壁老不好，电极紧密接触后，细胞就开始收宿，不知是什么原因？

A：sfboy
贴壁总不好，你的培养皿涂抹多聚赖氨酸了吗？要先酸化贴壁才会好，但有一个更方便的方法：每次都用新培养皿进行贴壁，但这样做的前提是你的经费要比较充足（当然从一定程度上考虑，还是比较浪费的）。
电极接触细胞开始收缩，说明你分离的细胞状态很不好，或者并不是特别耐钙，这时你可以仔细观察，通常会发现这样的细胞通常都会有轻度的自主收缩！
大鼠和兔子的配方肯定会不一样，这个需要你多查文献，在pubmed上检索一下你进行大鼠或兔子模型的配方，选择一种即可！
兔子心脏进行膜片钳实验优点为可以进行不同心肌层细胞的分离，更精确的研究不同细胞的离子通道特性；缺点就是兔子通常进行各种心脏疾病模型的制备较为繁琐，而且数量得不到保障。Q：ws9912
请教，在用单刺激记录Ikr和Iks时，有没有人试着在破膜后再改变EPC记录仪上的LJ值，有没有发现电流大小随着LJ的变化而变化啊？只是有次偶尔改变时发现电流也有所改变，后来又改变了几次，也出现了相同的情况，我就搞不懂了为什么会出现这种情况，LJ不是应该在电极入水前就设置好的，对吧？

A：xiaoxuanzi
LJ指的是liquid junction,用户可以自己设置（正负200mV之内），主要用来补偿液结电位，电极入液后，可以通过调节LJ或自动调节使基线调0，一般在电极入液后再按1使其自动调节，基线会归0，有时因为电极内外液的交换，基线会移动，那么再自动调节，基线会又归0，这时会显示跟刚才不一样的LJ值。所以你不要人为的去设一个LJ值，只要基线归0，LJ处具体显示多少不要管它，它主要反映液结电位，由你的内外液决定的。Q：zygrapewine
我这一阵子作试验集中的几个问题想请教各位兄弟姐妹，希望能多给我点教导指点。问题较多，，感谢大家回复。
下面有几个问题是我想集中请教：
膜片钳系统是axon公司的，放大器是CLAMPFIT 700B的，分析软件PCLAMP 10.0

1． 在lab banch中，低通滤波和高通滤波设置应该是多少KHZ范围？在程序中默认的设置是只选择了低通滤波0.2KHZ，我感觉这个数值好像太低了，老师有什莫建议，相应的采样频率应该设置多少阿？主要针对海马神经元的钠、钾通道。
2． 需要提前设置好液接电位补偿马？我从来没有设置过，只是在入液调节了PIPETTE OFFSET?
3． 我现在拉制的电极尖端在2微米左右，阻抗2-6兆欧，这个规格行吗？尖端太细是否影响封接？
4． 每次我在显微操作下尖端碰上细胞以后再进行正压吸引，发现有一小块膜进入尖端了，也有充放电电流的两个小尖了，这时候我在补偿后再破膜（用ZAP或者在加正压吸）就没有什莫反应了，几乎不出现非常明显的放电反应，所以都不知道膜破没破，做到这里就是迷迷糊糊的了，最后也就没有什莫明显的通道电流了，只有一次有一个图有一点类似钾电流。我用的电极液配方就是通用的那种全细胞电流的配方，没有加特殊的药物。不知道这里操作上有没有什莫问题，或者是经验手感不好，还请老师指点。
5． 我设置的采样PROTOCOL是钳制在-70毫伏，然后以10毫伏步阶电压上升至40毫伏，这样的电压设置正确吗？
6． 在电压钳制的时候，发现在放大器面板上可以设置电压，在膜测试的实时显示窗口也可以设置钳制电压，这两个只能设置一个，否则就会电压叠加，是这样吗？
7． 我尝试过急性分离大鼠幼崽的海马神经细胞，能用胰蛋白酶水解马？浓度0.125%30分钟（还是一定要用链酶蛋白酶？）但是用胰蛋白酶消化的组织很不容易吹打，很坚韧，这期间没有通氧气，发现分出来的神经细胞都圆了，而且没有轴突了，培养一两天才会正常，是不是我消化的步骤有问题，还是酶/没有通氧气的问题呢？
先问这些吧，感谢回复指点。

A：冷月寒星
我们实验室用的机器是 200B+pClamp8，只能谈谈自己的看法。还需要仁兄在实验中摸索，如有不妥还可讨论。
1。神经元细胞的Na、K通道，常采用的低通滤波在1-2KHz,以去除高频干扰；采样频率控制在10-20KHz，来说已经足够了。建议采用1KHz/10KHz 进行记录，0.2kHz略显低了一些。
2。PIPETTE OFFSET 即为将液接电位归零设置，无须另行设置。
3。2-6兆欧阻值进行神经元实验刚好合适，我们一般用4-6MΩ，电极如果过细的确影响封接。
4。通常我们进行负压吸引 ；如果补偿之后没有出现充放电波形，很可能没有形成全细胞构型。不知道，封接电阻期间如何变化的？ ZAP在我们实验室很少使用，国外好像用的多一些。
5。电位设置应无问题，刺激频率和时长设置可参考文献。
6。我们通常只进行软件holding设置，前面板holding通常不开，又看了下说明书未发现有holding电位叠加的提示，还请各位高手指点。
7。没分离过海马神经元细胞，只是见同学分过CA1，酶也是不通氧的，分离效果很好。另外消化过的神经元应该是没有突触的，培养过程中会慢慢长出。Q：anestiger 请教版主,我在急性分离大鼠心肌细胞时，老是发现无钙台式液冲洗8min，改为酶液灌注后左心室壁特别容易变白（相对右室壁），分出来的细胞也不好，死得多，状态不好。我检查了插管深度，也正常，没有过深堵了冠脉口。这种情况是为什么？怎么处理？有人注意过吗？与酶液有关吗？
酶液：胶原酶2 10mg，无钙台式液 50ml，bsa 35mg，灌流消化20min左右，不加钙（我发现加到终浓度为25umol/l的CaCl2都会出现区域性变白，所以就不加了）。

A：xiaoxuanzi
第1，测一下你灌流液和消化的PH值，PH值偏高会使心脏发白。第2，大鼠腹腔注射肝素，取下心脏时放心脏的恶4度液体也加肝素，以免血块堵住血管，如果解决了上述2个问题还发白，那换一种BSA或干脆不用BSA，有时不同批次的BSA会使心脏发白

A：冷月寒星
剪下组织时可有血栓，通常组织局部变白70%可能由于局部灌流不畅造成，首先取心过程要迅速，可预先肝素化处理。如经常出现，细胞消化效果不好 、组织变白的现象，可适当延长无钙液冲洗时间。
BSA 35mg 个人认为高了些，可降至12-15mg试一下。
另，酶解过程中一定要禁钙的，不知 anestiger 兄，将CaCl2 加至终浓度为25umol/l 是何用意？？

A：sfboy
你的BSA量不够，使其对心肌细胞的保护作用打了折扣；分离心脏发白的情况对于豚鼠来讲已经接近分离好了，但是对于大鼠来讲，还是不够的，试问：发白情况下分出的真的是细胞死得多吗？

我先前的经验是：对于大鼠，发白并不是分离过的指征，冠状动脉灌流后首先消化的是心外膜，最后才消化心内膜，因此大鼠细胞分离好的标准应该是心内膜肉红色消失！

因此，我认为你的消化时间还可以再延长，有助于你判断是否死得真是心肌细胞。

国内的配方尽量不要看，几乎做不出来！Q：ssvefc
请问分离细胞时，吹打的力度及频率是否对分离出来的细胞影响很大？请问大家在吹打时有什么技巧？谢谢

A：冷月寒星
您刚消化下来的细胞与稳定之后的细胞状态是否仍存在差异？
1。37度是酶活性最佳需要的温度，可根据不同的酶活性特征设定，一般设置在37度左右。而恒温灌流系统的温度和从心脏滴出的液体温度 如果系统完整的话，应该是一致的。
2。如上，恒温灌流系统的作用即为减少外界因素对灌流过程的温度影响，因此季节变化产生的温度差异，应对实验过程和参数设置没有太大的影响。
3。细胞多呈团块状，可以的出的结论是心脏在消化过程中消化不完全，可能与灌流状态有关，灌流过程中是否存在心脏局部灌流温度低的现象，或其他异常？
我们实验室应用的是2型胶原酶，不知道与您的胶原酶P 活性存在何种差异，但如按我的经验来看，您的酶量略微低了些，增加一倍的酶量应该是可以接受的。至于消化时间，实际上在实验过程中的出入还是很大的，需要根据具体消化状态相应选取，可在消化过程中分子取样，以尽量获得比较多的理想单个心肌细胞。
心肌消化条件须反复摸索，亦与动物状态有关，有时也须运气成分，顿悟之后您的实验多可一帆风顺了。
预祝诸位仁兄实验顺利Q：anestiger
谢谢冷月寒星，我说的酶液中加钙是指我的酶液配方中要求CaCl2浓度为75uM,我试了几次觉得不好，园子里有战友说可以降低浓度，但是不加钙分离的细胞会不耐钙，所以一直小量加。
还有，您用的也是2型胶原酶吗？酶液中不另外加钙剂吗？分离的是大鼠心肌吗？我的无钙台式液配方是：(mM) KCL 5.4，NaH2PO4 0.33，HEPES 5.0，GLucose 10，MgCL2 1.0，NaCL 140。 酶液：（mM）除NaCL为125mM，其余与无钙台式液浓度一致，另外还加Taurine 20mM，BSA35mg，及2型胶原酶10mg，CaCl2 2525umol/l 。您看看是否有问题？

A：冷月寒星
不加钙分离的细胞会不耐钙的说法我也听说过，但是是适用于对细胞状态不是很满意、希望改变酶解条件的战友适用，建议您先获得足够数目的细胞，即使有不耐钙的细胞存在毕竟可以在条件稳定后适当加入Ca++以调整细胞耐钙状态，因为在酶解过程中，原则上是Ca++越少越好的。
如果可以的话，建议不在酶液中加钙离子试验一次，因为即使您不加钙离子，在灌流液中也可能有少量的钙离子存在，这与您所适用的实验仪器和试剂有一定关系。
我们实验室在酶解的时候是从来不加钙的，多数情况下分离效果还可以，但偶尔也会出现细胞不耐钙的现象，但总还没有严重到影响实验。
我们的外液也是常用的配方：
无钙台氏液 :KCl 5.4, NaH2PO4 0.33, HEPES 10, Glucose 10, MgCl2 1.0, NaCl 126。 NaOH调pH至7.4。
用无钙台式液配制酶液，2型胶原酶 0.02%，可不加BSA或少量BSA。
Na+ 浓度与您的几乎没有差别，不足以影响到分离状态。
祝您实验顺利。Q：努力前进
我不是很清楚Ip and If 电流的方向。
1）是否可以这样理解，If 是膜通道开放后形成的电流，而Ip 是通过Vc 电压指令后形成的。如果是这样，您图中的Ip and If 的电流方向是否标反？
2）您说不能通过Vc得到Ip ，那为什么不能计算得到。Rf内部反馈电阻不是在放大器中固定的吗？而Vc可以知道，那为什么不能计算而到？是不是Rf是不能得到的 还是变化的？
3）如果If 和Ip 相等，那不每次的通道电流我都可以预先知道了？
我对这个电流图没有搞懂，不好意思麻烦您了！

A：冷月寒星
Ip是通过Vc的变化产生的,但电压依赖性离子通的通道电导是随不同膜电位变化的,而且您不知道通道电阻具体为多少,所以您没有办法通过计算得到Ip.
反馈电阻并不是固定的，当β=1时 Rf=500MΩ，当β=0.1时 Rf=50MΩ。并且对200b而言为电容反馈，其反馈电阻与一1pF的反馈电容并联。
在负反馈电路中，Vt-Vc=-IpRf，即Vo=IpRf。通过比较Vt与Vc的差异，反映电流值的大小，同时通过负反馈电路保持对细胞膜的钳制，其前提为产生的电流足够小。
我想您不理解的是Vc、Rf都是固定的为什么Ip或者If，不是固定的。
因为公式中的V是Vo而并不是Vc，将以上公式合并，Vc-Vt=IpRf，Vt和Ip均为变量，所以不同的细胞，不同的通道，您会在不同的点位下获得不同的跨膜电流。Vo为通过比较电路获得的差值。
您可以设定VC却须测得Vo，通过实验处理软件如pCLamp得到电流值，这就是膜片钳实验的意义，而不用手动计算电流值。
这是小弟的理解，我想sfboy、baxiansheng和xiaoxuanzi兄掌握的更深刻，如果小弟理解有误，还请指正。
电路这块，我也很头痛，实验结束后找机会学学电子知识再说。Q：努力前进
我还是有些地方不懂，请赐教。
1）反馈电阻指的什么？
2）当电压门控的离子通道开放后，形成的电流，是If吗？是否是反向流向Rf 和放大器的方向。这样会形成一定的电压降。这种电压降就可被Vo所测到？
3）当Vc形成的指令电压后，分配在Rf两端的电压就是Vc吗？那这样就可以形成电极电流Ip？
4）在Vt-Vc=-IpRf，即Vo=IpR中，负号是指电流的流向相反吗？还有您的Vt是什么意思？是每次不同时间形成的电压吗？是指的分配在哪个电阻两端的电压？关键是电流的图形我不懂。可能是有个放大器的缘故吧
谢谢了！真的不好意思再次的麻烦您！谢谢

A：冷月寒星
1。Rf 即为反馈电阻
2。通道开放形成Ip=If；电压降是由离子通道开放产生的细胞膜内外离子水平变化产生的，使得与钳制电位出现差异。通过A2比较两侧电位差异，即为V0
3。负号和方向没有关系，是因为Vt〈Vc，Vt-Vc是负的所以乘以-1以校正。
Vt是为了方便您理解，添加的。您要钳制细胞膜电位所设置的电位为Vc，而离子通道开放后随之细胞内外各种离子浓度发生微小变化，而导致细胞膜不能很好的钳制在您所希望的电位下，所获得的细胞膜电位为Vt（并非公认缩写，我加的代号，代表实时）。在检测电路中通过比较希望钳制的电位与实际细胞膜电位获得其差异值，即为Vo。
以上所附的电路图，只是膜片钳放大器缩略图的一部分。
您所疑惑的电流方向问题实际上与我们的实验，没有太大关系，您只需要知道膜片钳放大器通过负反馈放大电路，对细胞膜进行钳制就可以了。
除非您想自己制作放大器，这方面的知识华中科大实力雄厚，而且需要大量电子知识。
祝实验顺利