膜片钳系统

（一）Sutter P-97拉制仪

1、开左侧电源开关，预热10min。

2、运行RAMP TEST坡度测试，确定玻璃管的加热值，使加热能够熔化玻璃但又不至于烧断加热片。

警告：第一次使用拉制仪或更换加热丝、更换不同型号的玻璃时，都应该作RAMP TEST坡度测试，然后把RAMP TEST的值当做新编辑的程序的HEAT值。

下面是运行RAMP TEST的步骤：

（1）进入任一程序（按0-9 Enter回车）。

（2）按清除键<CLR>进入控制功能。

（3）按<0>不要清除参数数值。

（4）按<1>即能运行RAMP TEST 坡度测试。

（5）安装玻璃管和按<PULL>。

（6）记录RAMP TEST值，将用于设置HEAT。

3、做完RAMP TEST后记下它的值按RESET。选择一个程序，按光标提示输入测试得到的HEAT值，调整PULL、VELOCITY、TIME等参数值，设置拉制步数（Cycle）。

4、安装玻璃管：先将玻璃管安放在一侧的玻璃管夹的槽内，用旋钮固定，然后将玻璃管推过加热小室，用另一侧的玻璃管夹固定。

5、按“PULL”键，拉制电极

6、小心取下拉制好的微电极。

7、关闭电源。

注意：

1．不能用力按压玻璃管夹！将玻璃管推入加热小室时不能碰到加热丝！

2．用户要根据自己的需要先通过RAMP TEST确定HEAT值，再不断调整PULL、VELOCITY、TIME值，使之做一步二步甚至多步拉制达到自己的应用目的。

（二）微操纵器操作规程

SUTTER公司MP-285微操纵器由三部分组成：Controller控制器、Rotary Optical Encode（ROE）和用于固定电极的Manipulator。

1、打开MP285 Controller前面板的电源

2、拧开Manipulator部分固定探头的螺丝，转出探头，装上电极

3、在MP285 Controller的主菜单按1（快进模式），按ENTER

4、按MOV（MP285 Controller）
5、转动ROE三个转盘推进电极
6、接近细胞后按ROE上的COARSE/FINE按钮，灯亮后以FINE模式推进电极，进行封接。
7、完成后，撤掉电极，使Manipulator回到初始状态。

（三）Digidata 1322A

打开后面板的电源按钮，前面板绿灯和黄灯亮后即可正常运行。
（四）膜片钳放大器

1、打开MutiClamp 700A的电源开关，通过双击电脑桌面的快捷图标运行MultiClamp Commander。点击主界面的Channel 1 Mode，选择Voltage Clamp或Current Clamp模式，同时MultiClamp 700A控制面板正面相应的Voltage Clamp或Current Clamp指示灯会闪烁。

2、参数设置

Commander程序面板窗口中，先用按钮Reset to Program Defaults使所有参数恢复到默认值，然后在Options中进行如下设置：

（1）General

a） Sync Output中可根据需要选择Internal command或mode。

b） LowpassFilter Type中全部选Bessel。滤波频率可在Commander程序面板窗口中设定，其默认值为10 kHz，根据噪声情况，一般全细胞记录可采用2～5 kHz，单通道选5～10 kHz。

c） Gains

根据所记录电流的最大幅度选择反馈电阻，一般全细胞记录最大电流幅度在几十nA水平，故默认值为500 MΩ。单通道最大电流幅度在几百pA水平，可选5或50GΩ。其余不作改动。

d） Auto

如果不使用钳制模式的自动转换功能，此部分无需作改动。另外，在进行串联电阻补偿时，出现振荡的解决方法也可选择降低补偿程度（选第二项）。

设置完成后可保存为*.mcc文件，还可进一步采用Quick Select功能将该文件赋予给工具栏按钮，这样下次实验时可直接调用。上述设置的钳制模式为电压钳模式。

2、准备封接

（1）打开Clampex的Seal Test，设定封接测试脉冲电流方波的幅度与频率。

（2）在玻璃微电极内维持一定的正压，降低电极入液，在Seal Test中可见测试脉冲方波。观察电极电阻的大小。

（3）用Auto调节Pipette Offset，使I（pA）＝0。

3、封接

（1）使电极逐渐接触细胞。当电阻突然增大，电流降低1/3以上时，去除正压并轻轻给予负压吸吮以形成稳定封接。封接形成后，封接测试脉冲消失，仅出现电极电容瞬变值。

（2）观察封接电阻的大小，一般膜片钳记录要求封接电阻在1 GΩ以上。

（3）补偿电极电容：用Cp Fast和Cp Slow对电极电容进行补偿。

（4）漏电流（封接电流）的去除：单通道记录可选Leak Subtraction功能。建议采用Clampex的P/N Leak Subtraction功能。

（5）经过上述步骤就形成了细胞贴附式单通道记录模式。如要形成内面向外式，还需将膜片撕下。如要形成外面向外式或全细胞记录，还需打破细胞膜。

4、破膜

（1）继续给予负压吸吮或用Zap功能电击打破细胞膜。

（2）破膜后，缓慢撤除电极内的负压。

（3）进行膜电容补偿：选上Whole Cell，用Auto对膜电容进行补偿，必要时用手工进行细微调节。

（4）进行串联电阻补偿：选上RsCompensation和Disable if oscillation detected（或Reduce if oscillation detected），增大Prediction和Compensation对串联电阻进行补偿。

注：若要形成外面向外记录模式，可在步骤（2）后，缓慢地上提玻璃微电极，封接处附近的细胞膜会从细胞上脱离下来并自动融合。此时不用执行步骤（3）和（4）。

5、记录

关闭Seal Test。选择设定好的Clampex采样软件的Protocol，开始记录细胞电信号。注意：

（1）如果记录的基线不在零，可选Output Zero，用Auto对基线归零。

（2）如果噪声过大，可降低滤波频率。

（3）漏减功能最好选择Clampex中的P/N Leak Subtraction功能。

（4）细胞膜钳制电位也要使用Clamprx中设定的钳制电位。

（5）若单通道的电流幅度较小，可通过增大Gain获得满意的窗口显示。

注意：

1、充灌微电极时，只要电极内液液面能够和银丝相接触即可，过多的电极内液可能会溢出污染电极夹持器，还会增大导电半径，从而增大记录噪声。充灌完成后，用滤纸吸干残留在电极尾端的电极内液。

2、静电排除：冬季因气候干燥容易产生静电，为防止手上带静电，应先触摸接地的金属物体（如屏蔽网或显微镜），然后再触摸放大器探头。