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一：全自动膜片钳技术介绍：
膜片钳技术被称为研究离子通道的“金标准”。是研究离子通道的最重要的技术。目前膜片钳技术已从常规膜片钳技术（Conventional patch clamp technique）发展到全自动膜片钳技术（Automated patch clamp technique）。
传统膜片钳技术每次只能记录一个细胞（或一对细胞），对实验人员来说是一项耗时耗力的工作，它不适合在药物开发初期和中期进行大量化合物的筛选，也不适合需要记录大量细胞的基础实验研究。全自动膜片钳技术的出现在很大程度上解决了这些问题，它不仅通量高，一次能记录几个甚至几十个细胞，而且从找细胞、形成封接、破膜等整个实验操作实现了自动化，免除了这些操作的复杂与困难。这两个优点使得膜片钳技术的工作效率大大提高了！签于全自动膜片钳技术的这些优点，目前已经广泛的用于药物筛选。
1. Flip-Tip翻转技术：
将一定密度的细胞悬液灌注在玻璃电极中，下降到电极尖端的单个细胞通过在电极外施加负压可以与玻璃电极尖端形成稳定的高阻封接，自动判断封接形成是否良好并自动破膜形成全细胞模式。随后，药物化合物等可以被自动应用到管内进行全细胞模式实验。这种方式形成的膜片钳完全排除显微镜和显微操作，从而革命性的实现膜片钳技术的全自动化。它的显著特点是仍然采用玻璃毛坯作为电极。
2. SealChip技术：
完全摒弃了玻璃电极，而是采用SealChip平面电极芯片，一定密度的细胞悬液灌注在芯片上面，随机下降到芯片上约1-2μm的孔上并在自动负压的吸引下形成高阻封接，打破孔下面的细胞膜形成全细胞记录模式。采用这一技术的美国MDC（Axon）公司的PatchXpress 7000A 系统是高通量全自动膜片钳技术的典范，是离子通道药物研发的革命性工具，在国外实验室和制药厂广泛用于hERG通道药理学的研究。其通量最高为16，即一次可同时记录16个细胞。同时，其药物施加微量、快速，不仅用于药物筛选，还大量用于离子通道的基础研究。
3. Population Patch Clamp（PPC）技术：
同SealChip技术一样，完全摒弃了玻璃电极，而是采用PatchPlate平面电极芯片。该芯片含有多个小室，每个小室中含有很多1-2μm的封接孔。在记录时，每个小室中封接成功的细胞数目较多，获得的记录是这些细胞通道电流的平均值。因此，不同小室其通道电流的一致性非常好，变异系数很小。美国Axon（MDS）公司采用这一技术研发出了全自动高通量的IonWorks Quattro全自动膜片钳药物筛系统，成为药物初期筛选的“金标准”。
二：全自动膜片钳在药物筛选中的应用：
离子通道的实验研究最初主要来源于生理学实验。1949～1952 年, Hodgkin 等发展的“电压钳技术”为离子通透性的研究提供技术条件。60年代中期,一些特异性通道抑制剂的发现为离子通道的研究提供有力武器。1976 年Neher和Sakma发展的膜片钳技术直接记录离子单通道电流,为从分子水平上研究离子通道提供直接手段。80年代中期,生化技术的进步,分子生物学以及基因重组技术的发展,使人们能够分离纯化许多不同的通道蛋白,直接研究离子通道的结构与功能关系
全自动膜片钳技术一个重要的应用方向是检测早期药物化合物对hERG的毒副作用。hERG通道产生的电流是心室复极中最重要的电流。通道被药物后抑制直接导致Long QT综合症,很可能演变成尖端扭转型室性心动过速,心室纤颤,直至猝死。目前发现几乎所有的临床药物所至的LQT 或者TdP 都作用于hERG,且导致hERG抑制的药物在化学结构上没有明显的共性,从而很难预测,仅有通过实验的方式给予解决。2004年, ICH和美国FDA都颁布关于非临床检测Ikr (其中主要是hERG)的规章,要求药物上市时必须提供作用于离子通道的电流变化数据，否则新药不得用于临床。同时,根据该规章的要求美国FDA撤除由于致QT间期延长的处方药,约为全部从市场撤除处方药的40% 。为此,新的早期药物安全评测方式需要引入制药研发过程中,以便及早发现候选化合物潜在的心脏毒性,尽可能减少新药研发的投资与风险,而采用全自动膜片钳技术正是解决该问题的最佳选择。
事实上,制药企业还可以利用当前新兴药物虚拟筛选技术进行初筛,把初筛结果再结合全自动膜片钳技术进行实验上的验证。虚拟筛选技术, 即把已经测定三维结构的小分子化合物或者是多肽化合物与已经测定三维结构的生物大分子靶标(如离子通道) ,通过分子对接软件进行计算机模拟,最后得到小分子- 受体复合物的三维结构,而进行筛选研究。虚拟筛选的目的同样是从数十万到数百万化合物库中筛选出可能的小分子化合物,再进一步进行实验研究。把全自动膜片钳技术结合以离子通道为靶标的高通量虚拟筛选研究技术,无疑将会极大的缩短研究时间和节省大量的研究经费。
总而言之,全自动膜片钳技术具有如下的优点:效率高,是传统膜片钳效率的20～300倍;不需要专业电生理人员,简单易用,所有的操作可以在电脑软件控制的界面下完成,无须显微防震系统;大部分仪器的封接质量在1GΩ以上;部分仪器同时适用于研究配体门控通道和电压门控通道;主要应用于药物药理和毒理测试;在药物微量加样设计方面表现优秀;仪器主要工作方式为全细胞膜片钳方式。缺点:仪器仅适用于悬浮细胞实验。无疑地,随着基因组测序的完成和蛋白质组学的兴起,离子通道在未来的细胞与药物方面研究将会变得越来越重要。与此同时,作为离子通道研究的最佳伴侣- 全自动膜片钳,由于其独特的优点也必定在这一领域大展身手。
(责任编辑：泉水) |
