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培养的心肌细胞做膜片钳的准备?

时间:2012-08-05 09:22来源:网络 作者:未知 阅读:

 

胚胎心肌细胞的分离及培养(在无菌条件下操作):
将所需要胎龄的孕鼠取出,以颈椎脱臼法处死后,剪开腹腔,找到子宫, 取出胚胎,置于冰PBS(mmol/L)溶液(NaCl 120、 KCl 5.4、 MgSO4 5、 Na-Pyruvate 5、 Taurine 20、 HEPES 10、 Glucose 20)中。去掉胎膜及胎盘,用尖镊子将心脏取出放入另一盛有冷PBS培养皿中,置于体视显微镜下,分离出心房和心室(在10.5 d之前,心房尚未发育)。把心房和心室剪碎分别置于酶解液中(Collagenase B:1mg/ml, Roche Molecular Biochemicals, Mannheimm, Germany; CaCl2 10mmol/L, 3μl/ml)酶解,温度37 ℃,时间35~37 min。用KB(mmol/L)液(KCl 85、K2HPO4 30、 MgSO4 5、 EGTA 1、Na2ATP 2、 Pyruvate 5、Kreati 5、 Taurine 20、 Glucose 20)终止消化并震荡30 min后,将分离下来的单个心肌细胞(大约5×105~1×106个/ml)2~3滴滴入预先放有盖玻片(预铺明胶)的培养皿中,加含有20%胎牛血清的DMEM培养基(Gibco公司),置于37℃,5%CO2培养箱中培养。24 h后,选用跳动的心肌细胞进行膜片钳实验。
利用膜片钳技术进行离子通道研究时,要求细胞形态结构完整、平滑,以利于和玻璃微电极进行高阻抗封接,并且在破膜形成全细胞记录方式后,细胞能保持较好的活性。因而,制备高质量的单个细胞是完成膜片钳实验的关键,然而,再分离细胞的过程中,有很多因素如溶液的成分、pH,酶,温度等都会影响分离细胞的数量和质量。
本文所用的方法不仅获得的细胞数量多,而且由于我们分离获得的单个细胞是长在盖玻片上,所以细胞贴壁牢固,用于做膜片钳实验效果好。经24 h培养后细胞状态良好,胚胎心肌细胞跳动。我们的成功经验与体会是:(1)迅速取出胚胎,快速去掉胎膜和胎盘,以免胚胎缺氧。(2)温度是影响分离细胞成功率的重要因素,取出的胚胎心脏要置于4℃的PBS溶液中,可减弱心肌组织的代谢,从而保护心脏组织。(3)酶也是影响分离细胞成功率的关键因素。一般成年鼠心肌细胞的分离使用I型胶原酶,由于胚胎心肌组织娇嫩,故我们选用胶原酶B,一种较温和的消化酶进行消化。(4)细胞的密度;由于消化分离出的细胞要培养24h,故将分离出的单个细胞滴在盖玻片的数目不要太多,以免长成片,而不能进行单个细胞的膜片钳实验。(5)细胞在分离过程中要保持无菌,否则细胞受到污染后生长不好,细胞状态也不好。

引自----------------
小鼠胚胎心肌细胞的分离及电生理特性
骆红艳 唐明* 胡新武 宋桂利 梁华敏 杜以梅 张毅

 

(责任编辑:泉水)
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