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膜片钳实验系统配置

时间:2012-08-04 13:26来源:网络 作者:未知 阅读:

膜片钳实验系统配置
膜片钳实验系统配置

一个电生理配置有4个主要的需求:

环境需求:保持标本的健康的手段。

光学需求:显现标本以供观察的手段。

机械结构需求:稳定定位微电极的手段。

电子学需求:放大和测量信号的手段。

我们将配置分成两种类型的“典型”配置:胞外记录和单通道膜片钳记录。

胞外记录的配置

该配置主要用于记录脑片的场电位。一般目标是将一个相对粗糙的电极放置在组织的胞外空间,同时尽可能模仿体内的组织环境。因此,需要一个相当复杂的小空腔,用来对组织进行温暖、氧化、灌注。而另一方面,光学和机械结构需求则简单得多。一个显微镜,至少15cm的工作距离(配合近似垂直放置的微操纵器),通常已经可以看到切片或大体的形态学特征。由于对定位时手的震动和电极的精确放置都没有苛刻要求,微操纵器可以选用相对粗糙的机械类型。但是,在记录过程中,微操纵器不允许有一点漂移和震动。
需要使用低噪声的电压放大器。由于信号的范围可能在10 uV 到10 mV 范围内,低噪声电压放大器的增益至少要达到1000。

单通道膜片钳记录配置
标准的膜片钳配置在许多方面与胞外记录恰好颠倒过来了。由于对环境的控制非常少,实验通常在室温下、一个无灌注的培养皿中进行。
光学和机械需求则根据实际的细胞的大小(10或20 um)有特殊的规定。显微镜应该有放大300或400倍的能力,并需要某种对照增强能力(Nomarski, Phase or Hoffman)。Nomarski(微分干涉)对于电极的精确放置是最好的,因为它的影像依赖于视野一个很窄的深度上,这有助于精确定位(定位不好,影像是模糊的)。Phase(相差法)用于精确定位程度要求低一些的场合,但提供了更好的对比度。Hoffman方法提供了较便宜的,稍微退化点的Nomarski版本。

最好使用倒置显微镜(如奥林巴斯的倒置研究级显微镜IX71/IX81):

(1) 这样能使电极顶端更容易被看到,因为物镜在chamber的下方,

(2) 提供了更大更坚固的平台,用来固定微操纵器。

微操纵器应提供良好的,平滑的移动(最多每秒2um)。对震动和稳定性的需求决定于记录模式:是希望记录cell-attached- patch,还是cell-free (inside-out or outside-out) patch。
在cell-free- patch中,微操纵器只需要在形成封接过程中保持稳定,一旦离开了细胞,稳定就不是那么至关重要了。这通常不到一分钟。

单通道记录的放大器比胞外记录使用的要复杂得多。

组织切片膜片钳记录配置

膜片钳技术的近来扩展,切片膜片钳技术,其配置需要是体外胞外记录和常规膜片钳配置的一个组合。例如,该技术可能需要一个chamber,需要连续对切片进行灌流和供氧。大部分的其他要求,与常规膜片钳类似。光学需求与切片的厚度有关(thick-slice or thin-slice),对thick-slice,简单的解剖显微镜就够了(如奥林巴斯的解剖SZ和SZX系列显微镜);而对thin-slice,显微镜则需要提供400倍的放大,良好的顶端聚焦和对照增强。

设备放置
电生理实验人员倾向于在小房间的一角独自工作。小房间通常比较安静,震动和空气流动被削减了。
首先放置显微镜是比较明智的,然后是密切联系的附件,例如chamber,微操纵器和温度控制系统(如果安装了)。基本原则是第一要保证细胞恰当的处于静止状态,第二要确认从细胞记录信息的行为没有对细胞带来连续的致命伤害。

第一原则可以通过良好的实验环境帮助实现,第二原则通过良好的光学和机械手段实现。
在显微镜周围工作,保持例如灌注阀门和微操纵器的控制要非常谨慎,避免震动。理想的情况是,它们放置在一个小架子上,该架子从防震台延伸出来,保证在通过显微镜观察细胞时,不会产生破坏的震动。
选择和放置电子仪器是个人偏好的事情。最低的要求是只有一个放大器和一台计算机,另外强调最好放置在一个仪器架上。一个示波器是重要的,因为,计算机通常不够灵活;而且,示波器常能展现在计算机屏幕上看不到的一些意外情况,例如计算机的采样率设置不合适时,就会丢失大量细节信息,而示波器则不会。
示波器应与眼睛水平,在示波器上面或下面直接放置微电极放大器,以便容易的调整和监视信号。
计算机应放置得尽可能远,但离显微镜还是应该保持在手臂来回够得着的地方。这有助于削减显示器的辐射噪声,也能确保在使用键盘匆忙记录时不至于肘部撞击显微镜。

(责任编辑:泉水)
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