首页 | 家园 | 百科 | 下载 | 书库 | 仪器 | 展会 |人才 | 公司 | 网址 | 问答 | 论坛 | 注册 | 通行证登录 | English

生物行

生物行   进展 | 摘要 | 人物 | 医药 | 疾病 | 技术 | 健康 | 能源   生物航   供应 | 求购 | 公司 | 展会 | 要发布
论坛   神经科学 | 神经系统疾病 | 实验技术 | 求职招聘 | 器材试剂 | 文献检索 | 读书笔记 | 考试招生 | 软件使用
当前位置: 主页 > 生物技术 > 电生理 >

膜片钳技术标准化操作规程

时间:2012-08-05 08:49来源:网络 作者:未知 阅读:

膜片钳记录系统简介:膜片钳技术是细胞电生理方面的高端技术,是研究细胞膜离子通道的重要工具。目前细胞膜离子通道的研究已经应用到了药物作用、环境对细胞膜离子通道的影响、神经网络研究以及疾病的诊断和治疗等多个领域。膜片钳技术是神经科学、心血管、药物学和药效学、功能基因组学和许多遗传病深入研究的有力手段。

主要设备:PC-2B放大器、AXON200B放大器、正置显微镜、倒置显微镜、NIR-DIC成像系统、水镜头、微操纵器、微电极拉制仪、抛光仪、振动切片机等。
仪器功能及应用范围:单细胞膜片钳记录(急性分离细胞、培养细胞)、脑片膜片钳记录(盲法、可视法)

脑片膜片钳实验流程(PC-2
一、脑片制作
1.  配制新鲜蔗糖溶液(4°C)和NaCl孵育液(室温,20~25°C)各1L。
2.  用丙酮浸泡刀片30 min。
3.  麻醉动物:爪蟾—MS-222,大鼠—乌拉坦。
4.  解剖动物,取脑组织。
5.  切片:根据不同的动物和组织选择不同的方案。
方案一:低熔点琼脂包埋组织后进行切片。
方案二:普通琼脂作托进行切片。
6.  处理脑片:蔗糖溶液中40~60min(4°C或32°C)。
7.  孵育脑片:NaCl溶液中放置0.5~1h(室温)后可进行膜片钳实验。
注:脑片制作过程需全程通入95%O2+5%CO2混合气。

二、全细胞膜片钳记录
(一)盲法
1.  将脑片置于灌流槽内,用银丝压牢,并确保灌流系统通畅、稳定。
2.  双手接触屏蔽罩以释放操作者身体静电。
3.  打开放大器POWER→ON,记录模式选择SEARCH档。
4.  打开IBBpatch-clamp软件,点击 按钮,监测电流及电阻变化。
5.  系统holding选择 -50~ -80mV。
6.  安装玻璃微电极。
7.  用注射器给电极内施加适度正压。
8.  降低电极入水,并接近脑片。
9.  封接:用微操纵器推动电极接触脑片,并逐渐向脑片深处推进,当电阻突然增大,电流降低1/3以上时,释放注射器内正压,缓慢抽吸,逐渐形成千兆欧姆封接(gigohm)。
10.  破膜:轻拉注射器,突然出现大的电容电流,表明已破膜,Whole-cell 模式形成。
11.  迅速点击 按钮,记录模式选择VC档。
12.  点击 按钮,可观察电流变化,但是不记录、不保存。点击 按钮,可观察并保存电流变化。
(二)可视法
基本步骤同盲法,不同的是需要在步骤8之前打开监视器的DVCView软件,在水镜头下找到目的细胞后再将电极入水,逐渐接近脑片直至到达该细胞,在可视的情况下完成后续步骤。

单细胞膜片钳实验流程(AXON200
一、单细胞急性分离
一般过程为:解剖→切片→孵育→消化→洗酶→吹打→细胞贴壁。
以急性分离大鼠海马神经元为例叙述如下:
1.  配制人工脑脊液(ACSF) 250ml。
2.  解剖:断头取脑,在冰冷(0~4°C)ACSF中取出海马。
3.  切片:将海马沿矢状位切成400~600μm厚的脑片。
4.  孵育:脑片在ACSF中室温下孵育50min。
5.  消化:将孵育后的脑片移入酶消化液中,32°C消化25min。
6.  洗酶:用ACSF洗脑片3次。
7.  吹打:依次用口径递减的三个吸管轻轻吹打脑片,制成单细胞悬液。
8.  贴壁:将单细胞悬液竖直静置5min,吸取上方细胞悬液加到培养皿中,约30min后细胞贴壁,即可进行膜片钳实验。
注:细胞急性分离过程需全程通入95%O2+5%CO2混合气。

二、全细胞膜片钳记录:
单细胞膜片钳实验需要在倒置显微镜下进行,其步骤与脑片膜片钳记录过程基本相同。由于可直接看到细胞,故可以将微电极直接接近并接触目的细胞,完成封接、破膜等一系列过程。软件设置和放大器操作不同之处主要有以下几点:
1.  按下放大器POWER,记录模式选择Vm档
2.  进入记录软件:开机后按F8键进入MS-DOS系统→ 输入“cd pclamp6”命令 → 输入“clampex / fetchex”进入记录界面。
3.  File选择预先设定好的刺激参数。
4.  Trial → TestSeal 监测电流变化,进行封接和破膜,形成全细胞模式。
5.  记录模式选择VTRACK档
6.  Trial → View 观察电流变化,但是不记录、不保存。
7.  Trial → Record可观察并保存电流变化。

拉制仪操作流程
采用两步法拉制玻璃微电极:
1.  打开电源POWER(-),预热10min。
2.  调节拉制参数。
第1步拉制参数:将左侧旋钮旋置NO.1 HEATER,再旋转右侧第一个旋钮NO.1 HEATER ADJ,调到所需参数。
第2步拉制参数:将左侧旋钮旋置NO.2 HEATER,再旋转右侧第二个旋钮NO.2 HEATER ADJ,调到所需参数。
注:调节参数过程的动作要迅速,持续时间不宜过长。
3.  将左侧旋钮置于STEP2位置。
4.  安装电极,将加热丝旋到上方,按START,完成第一步拉制。
5.  将加热丝旋下,待加热丝完全变暗后,按START,完成第二步拉制。
6.  关闭电源POWER(○)。

 

 

 

 

 

(责任编辑:泉水)
------分隔线----------------------------
发表评论
请自觉遵守互联网相关的政策法规,严禁发布色情、暴力、反动的言论。
评价:
表情:
用户名: 验证码:点击我更换图片
推荐内容