上海第二医科大学附属瑞金医院麻醉科 薛庆生 综述 于布为 审校
　
　　脑片是指从哺乳动物脑区制备的厚约100～700μm、能够在体外存活一定时间的薄片。脑片标本实际上是一种短时间移植培养的制备技术。该技术起始于20世纪50年代Li和Mcllwain开创的离体脑片电生理研究，到20世纪80年代，研究区域已经出现了皮层、海马、纹状体、小脑、下丘脑、脑干等不同部位，实验方法也打破了电生理学的局限，发展到了病理生理、生物化学、药理学、分子生物学等诸多领域。
　　脑片兼有在体脑实验和离体神经细胞培养的某些特点，与培养和急性分散的神经细胞相比，脑片的优点是：①离体脑片在体外48小时内依然保持良好的活性，离子通道性质不会发生变化，而神经元经培养或急性分离后，离子通道在细胞膜上的分布及性质会发生显著的变化；②离体脑片保持有完整的神经突起和神经解剖通路，便于研究突触活性；⑧脑片实验可选用成年动物，而神经细胞培养只能使用新生动物。脑片同在体脑相比：①脑片排除了血压、温度、电解质、血脑屏障等因素的干扰，通过改变灌流人工脑脊液或气体的成分，实现对标本环境的控制，调节或改变神经元的兴奋性；②脑片标本具有有序的神经元和纤维排列以及完整的神经解剖通路，可在解剖显微镜下直接定位，便于电生理操作，脑片能够复制出整体动物大多数电生理现象，模拟在体实验。 目前，脑片技术已被广泛地应用于神经科学研究，其中，海马脑片更成为研究人类学习记忆功能和神经系统突触可塑性的良好标本。脑片也成为麻醉药理研究中重要的技术手段，并在国外实验室内被广泛的采用，国内麻醉药理研究也逐渐重视脑片技术的优越性。为此本文对近年来发展的一些脑片实验方法和它们在麻醉药理研究中的具体应用作一个综述。
1 脑片种类和实验方法
　　多数脑片实验采用的是大鼠、小鼠、豚鼠、猫的脑组织。皮层、纹状体、海马、丘脑、小脑、脑干等是经常选用的区域。电生理记录是使用最多的研究方法，其他还有病理形态学分析、神经递质释放测定、分泌蛋白检测、蛋白基因表达等神经功能实验方法，以及同时使用多种方法的实验研究。在研究方法上又可分为制备脑片后立即实验的急性期研究和培养脑片的慢性研究，后者可以观察到神经系统功能的慢性改变。
1.1 脑片制作：
　　脑片制作是一个创伤过程，保持脑片组织的高度活性，尽可能降低脑片切取时的制作损伤是实验成功的保证。维持合适的人工脑脊液环境(酸碱度、离子浓度、温度)，降低细胞能量代谢消耗(低温，预先使用麻醉药物)，仔细熟练的操作技巧是降低脑片制作损伤的关键。年幼动物的脑片制作简单，与成年或老年动物相比，其损伤后组织活性恢复快，适合于简单的研究，但是其结果不能适用于其他年龄组动物。关于制备脑片前，是否需要使用麻醉药物，研究人员的观点不相一致，支持者认为这样可以减少神经细胞的氧耗，减轻脑片制作损伤；反对者认为使用全身麻醉药物影响以后的实验结果分析。在关于麻醉药理的脑片实验研究中，也同样存在这样两种不同的制作方法，这不利于实验结果之间的比较分析。
1．2 研究方法?
1．2．1 电生理记录?
　　海马脑片因有序的片层结构特点，方便的突触、神经纤维定位而多被应用于电生理学实验研究，此外，海马也是脑组织对缺氧最敏感的部位之一，因此，海马脑片已广泛应用于脑缺氧损伤机制和药物保护作用的研究。成为较理想的离体缺氧损伤模型。电生理记录区域多集中在CAl区，也有在CA3和齿状回区域记录。记录方法有细胞外记录：刺激CA3的谢弗侧枝(Schaffer collateral)产生的CAl区锥体细胞顶树突层的场兴奋性突触后电位(field excitatory postsynaptic potential fEPSP)和CAl区锥体细胞层的群体峰电位(population spike，PS)(见图)，这两种电位也是学习记忆和突触可塑性研究中长时程增强(LTP)和长时程抑制(LTD)实验的观测指标。在CAl区PS记录中，谢弗侧枝是单突触谷氨酸能神经传导通路，能够被抑制性中间神经元折返抑制，双脉冲易化(paired-pulsefacilitation　PPF)现象是指用双脉冲刺激谢弗侧枝，第二个PS(PS2)的幅度大于第一个PS(PS1)，它反映了GABA能抑制性中间神经元功能和药物的突触前作用机制。CAl区锥体细胞峰电位(spike)，兴奋性突触后电流(EPSC)和抑制性突触后电流(1PSC)是细胞内记录的主要指标。海马脑片的这些电生理记录与整体实验研究完全一致。脑片膜片钳记录技术是20世纪90年代开始创立并逐渐开展起来的新型电生理学方法，它使从分子水平研究细胞膜单离子通道功能的设想变成了现实。红外微分干涉相差(1nfrared differential interference contrast，IR-DIC)显微镜应用于脑片，能够清晰地观察到脑片上神经元及突起的形态。IR-DIC技术已成功应用于海马脑片全细胞膜片钳记录，并记录到树突的动作电位。海马脑片盲法膜片钳记录技术因具有设备相对简单、神经元和突触联系完整无损的优点，适合于国内实验室开展，目前已有部分国内实验室建立起了该项研究技术。
1．2．2 形态学分析?
　　脑片实验中，形态学的研究方法主要指病理切片和各种特殊细胞染色镜检。通过常规苏木精-伊红(HE)染色光镜观察，能够了解组织细胞的活性和形态变化。透射电镜、碘化丙啶(P1)荧光染色、凋亡细胞标记(TUNEL法)可以观察到神经细胞死亡的方式。免疫组织化学和细胞化学方法能够了解脑片中特定蛋白含量的变化。当脑片遭受缺氧缺糖损伤后，海马CAI区锥体细胞因结构破坏而透光性会发生改变，观察这种透光性变化可以方便有效地研究缺血损伤和药物的保护作用。利用倒置显微镜直接观察海马脑片中实质动脉直径变化的方法，被用于药物对脑血管的作用效果和机制的研究中。核素标记后的放射自显影技术也是脑片形态学研究中常用的方法。
1.2．3 其它功能学实验方法?
　　除电生理学方法外，通过灌流液体定量观察脑片中神经递质和多肽的释放水平变化是考察脑片活性，神经细胞功能、药物作用机制的常用方法。通过电刺激、细胞外高浓度钾离子、外源性释放剂(谷氨酸、藜芦碱)等方法刺激脑片，采用生化检测、高效液相色谱(HPLC)分析等方法可检测释放出的神经递质或多肽，预先用核素标记的神经递质与脑片共同孵育，采用放射免疫分析方法也能够精确测定神经递质和多肽的变化。快速周期伏安法(fast cyclic voltammetry FCV)被用来测定纹状体脑片多巴胺释放率。氯化三苯四唑氮(TTC)染色是观察细胞活性和能量代谢的方法，常用于离体脑缺血损伤评价。脑片细胞内ATP、Na+、K+、Ca2+浓度测定、脑片孵育液中分泌蛋白含量、乳酸脱氢酶等生化指标检测也是功能实验中常用的方法。分子生物学技术的发展丰富了实验研究的手段，原位杂交、基因、蛋白表达分析、反义技术也同样适合脑片实验。膜片钳与逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术结合使单个神经细胞离子通道功能和蛋白表达体外扩增分析成为可能。转基因技术产生了特定基因缺陷的动物，研究其脑片各项功能指标的变化，可以从反面证实基因的真实作用。
2 脑片技术在麻醉药理研究领域的应用
　　麻醉药理研究中，脑片技术主要应用于全麻原理，麻醉药物对突触可塑性的影响，药物的脑保护作用及其机制等诸多领域。
2．1 全麻原理和突触可塑性的研究
　　全麻原理的蛋白质学说认为：全身麻醉药物通过激活中枢神经系统抑制性受体功能和或抑制兴奋性受体功能而发挥麻醉作用。脑片技术因具有较完整的突触联系和神经递质-受体系统而成为全麻原理研究的重要手段。
　　海马脑片膜片钳记录CAl区中间神经元1PSCs的研究发现：氟烷、安氟醚、异氟醚和七氟醚可增强大鼠海马中间神经细胞GABA?A受体介导的抑制性突触传递。氟烷和异氟醚抑制海马CAl区PS，增强PPF现象也提示突触前和突触后机制都参与了它们对兴奋性传导的抑制作用。氟烷、异氟醚、安氟醚也通过GABA?A受体抑制大鼠皮层脑片神经元的自发动作电位发放。通过特异性受体阻断剂研究发现：氟烷和异氟醚对海马CAl区NMDA受体介导的兴奋性和GABAA受体介导的抑制性突触传递均有调制作用。异氟醚通过GABAA受体抑制小鼠海马脑片LTP的形成，并认为这与异氟醚麻醉后认知功能受损有关。七氟醚抑制海马CAl区PS，增强PPF现象，特异性的受体阻断剂提示GABAA和GABAB受体都参与了七氟醚的抑制效应。大鼠海马脑片中实质动脉直径的研究观察证明：氟烷扩张颅脑动脉的机制部分是增强神经源性一氧化氮合酶产生的一氧化氮所致。?
　　静脉麻醉药物增强中枢抑制性突触传递。异丙酚通过激活GABAA受体促进氯离子内流而抑制海马脑片CAl区的PS和EPSp。通过GABAA受体p3亚基基因突变型的小鼠海马脑片锥体细胞全细胞膜片钳研究发现：异丙酚和乙咪酯对GABA激活的氯离子电流增强作用弱于野生型小鼠脑片，这提示GABAA受体的β3亚基是静脉麻醉药物的作用部位之一。异丙酚对突触可塑性的影响表现 为抑制大鼠海马LTP的维持，促进LTD形成。咪唑安定也是通过GABA A受体抑制大鼠海马脑片LTP的形成。?
2．2 脑损伤保护及机制的研究?
　　利用离体脑片能够方便有效地建立损伤模型，并采用多种方法研究麻醉药物的脑保护作用和具体的机制。
　　通过生化方法检测灌流液谷氨酸浓度发现：安氟醚和氟烷的脑保护作用表现为抑制皮层脑片缺氧产生的谷氨酸释放量。大鼠海马脑片病理切片镜检观察也证实异氟醚对缺氧缺糖损伤导致的神经元死亡和迟发性神经细胞凋亡都具有保护作用，并能拮抗谷氨酸的神经毒性。快速周期伏安法测定纹状体脑片多巴胺释放率也证实异氟醚有脑保护作用。七氟醚的脑保护作用表现为抑制缺血损伤所致大鼠皮层纹状体脑片谷氨酸、天冬氨酸和多巴胺的释放。?
　　脑缺血离体实验中的缺氧缺糖损伤可导致海马脑片CAl区PS电位减弱甚至消失，氯胺酮、硫喷妥钠、咪唑安定能够促进这种损伤的PS电位恢复，咪唑安定还能够抑制缺氧时海马脑片神经细胞ATP浓度降低，减少钙离子内流。通过快速周期伏安法测定纹状体脑片多巴胺释放率和TTC染色检测皮层纹状体脑片细胞活性这两种实验方法，证实氯胺酮对脑缺血损伤具有保护作用。利用脑片研究异丙酚脑保护作用所得到的实验结果与在体和细胞培养实验结果不一致，虽然异丙酚能够抑制海马脑片缺氧缺糖损伤产生的ATP下降和Na+、K+、Ca2+的浓度变化，但是电生理研究未发现异丙酚能够促进PS恢复，它对脑片缺氧缺糖损伤无保护作用，而且还会加剧兴奋性氨基酸介导的神经毒性，通过缺氧缺糖损伤后海马CAl区锥体细胞透光性变化的观察，也未发现异丙酚有保护作用。硫喷妥钠的脑保护作用表现为：抑制海马脑片缺氧缺糖损伤所致的神经细胞死亡，神经细胞钙离子增高，降低锥体细胞的透光性，减少皮层脑片缺血损伤产生的谷氨酸释放增加。对于缺氧破坏的海马脑片PS电位 ，氧化亚氮无保护作用，相反还会加重PS的损伤，对缺氧产生的ATP、Na+、K+、Ca2+等生化指标变化也无改善作用，所以氧化亚氮没有脑保护作用。?
　　脑片技术在麻醉药理研究中还涉及到疼痛机理，麻醉药物毒性研究等方面。目前，它已成为麻醉药理研究中的一项重要手段，但是，作为一种离体实验方法，从脑片实验获得的结果还需通过在体实验来验证。随着，不同实验方法的整合，越来越多的技术手段将会被用于脑片实验，脑片技术也将会在全麻原理、脑保护机制等麻醉药理研究中发挥更加重要的作用。
　 

参考文献
1 张均田主编．现代药理学实验方法．北京：北京医科大学中国协和医科大学
联合出版社，1998：1039-45.?
2 张均田主编．神经药理学研究进展．北京：人民卫生出版社，2002：137-150.
3 于英心．离体海马脑片的电生理研究．生理科学进展，1984；15：202-6.?
4 Hirota K，Roth SH．Sevonurane modulates both GABAA and GABAB receptors
in area CAl of hiPPocampus.Br J Anaesth，1997；78：60-5.?
5 MaclVer MB，Mikulec AA Amagasu SM．Volatile anesthetics depress glutamate
transmission Via presynaptic actions．Anesthesiology,1996；85：823-34.?
6 Qi S，Zhan RZ，Wu C et al．The efiectS of thiOpental and propofol On Cell
swelling induced by oxygen／glucose deprivation in the CAl pyramidal Cell layer
of rat hippocampal slices．Anesth Analg，2002；94：655—60.?
7 Staunton M，Drexlef C，Schmid PG，et d．Neuronal nitnc oxide Synthase
mediates halothane-induced cerebral microvascular dilation．Anesthesiology,
2000；92：125-32.?
8 Toner CC，Connelly K，Whelphton P，et al．EfieCtS Of sevonurane on dopamine，
glutamate and aspartate release inan Vitro model of cerebral iSchemia． Br J
Anaesth，2001；86：550-4.?
9 Toner CC， Milne AJ， Blatchford KL， et d． An assessment of the cerebroprotectiVe potential of Volatile anaesthetics using two independent methodS in an in vitro model of cerebral ischaemia．Brain Res，2002；958(2)：390-8.?
10 Watson GB，Lopez OT，Charles VD， et al．Assessment of long-telme fiects of transient anoxia on metabolic activity of rat hippocampal Slices using triphcnyltetrazolium choride．J Neurosci Methods，1994，53(2)：203，8.
11 Miller KW The natute of sites of general anaesthetc action．Br J Anaesth，20 02；89：17-31.?
12 NiShikawa K，Maclver MB．Agent-selective efiects of volatile anesthti cs on GABA A receptor-mediated synaptic inhibition in hippocampal intemeurons．A nesthesiology,2001；94：340-7.?
13 Antkowiak B，Helfrich-Forstef C. Effects of small concentrations of volatile
anesthetics on action potential firing of neocortical neurons ln Vitro ．AnesthesiOlOgy,1998；88：1592，1605.?
14 Wakasugi，Hirota K，Roth SH，etal．The efiects of general anesthetics on exc itatory and inhibitory Synaptic transmission in area CAl of the rat
hippocampus in Vitro．Anesth Analg，1999；88：676-80.?
15 Simo W,Hapfelmeier G，Kochs E，et al．Isoflurane blacks synaptoc plasticity in the mouse hippocampus．Anesthesiology,2001；94：1058-65.?
16 Albertson TE,Walby WF,Stark LG,et al.The effect of propofol on CAL Pyramida l cell excitability and GABA?A-mediated inhibition in the rat
hippocampal slice.Life Sci,1996;58:2397-407.?
17 Jund R,Arras M,Lambert S,et al.General anesthetic actions in vivo strongly
attenuated by a point mutation in the GABAA receptor beta3 subunit.FASEB J,
2003;17:250-2.?
18 Wei H2 Xiang W,Yang S,et al,Propotol facicitates the devetopment of long-ter m depression (LTD)and impairs the maintenance of cong-tern pptentiation(LTP)in t he CAI region of the hippocampins of anesthetized rats Metrosci Lett,2002;181-4 ?
19 Evans MS,Viola-Mccabe KE,Midazolam inhibits long-term potentiation
through modulation GABA A receptors.Neuropharmacology,1996;35:347-57.?
20 Bickler PE,Buck LT,Feiner JR.Velatile and intravenous anestheeics dercrease ghitaMate release trom corticou brain slices dcoing ahoxia.Anesthesiology.1995;8 3,1233-40?
21 Popovic R,Liniger R,Bickler PE.Anesthetics and mild hypothermia similarly
prevent hippocampal neuron death in an vitro model of cerebral ischemia.
Anesthesiology,2000;92:1343-9.?
22 Sullivan BL,Leu D,Taylor DM.Isoflurane prevents delayed cell death in an
organotypic slice culture model of cerebral ischemia.Anesthesiology,2002;96:189- 95.?
23 Zhen RZ,Qi S,Wu C,et al.Intravenous anesthetics differentially reduce
neurotransmission damage caused by oxygen-glucose deprivation in rat
hippocampal slices in correlation with N-methyl-D-aspartate receptor inhibition.
Crit Care Med,2001;29:808-13.?
24 Abramowicz AE,Kass IS.Midazolam improve electrophysiologic recovery after an oxia and reduces the changes in ATP levels and calcium influx during anoxia in t he rat hippocampal.Anesthesiology,1991;74:1121-28.?
25 Mathews KS,Toner CC,Mclaughlin DP,et al Comparison of ketamine stereoisomers on tissue metabolic activity in an in vitro model of global cerebral ischaemia. Neurochem Int,2001;38:367-72.?
26 Amorim P,Chambers G,Cottrell J,et al.Propofol reduces neuronal transmission
damage and attenuates the changes in calcium,potassium,and sodium duringhyperthe rmic anoxia in the rat hippocampal slices.Anesthesiology,1995;83:1254-65.?
27 Amorim P,Chambers G,Cottrell J,et al.Nitrous oxide impairselectrophysiologic recovery after severe hypoxia in rat hippocampal slices.Anesthesiology,1997;87: 642-51