有一种蛋白在细菌免疫系统中起着至关重要的作用，并正快速成为一种很有用的遗传工程工具。现在有关这一蛋白的一个中心问题已经获得了解答。

来自劳伦斯伯克利国家实验室和加州大学伯克利分校的研究人员，确定了这一叫做 Cas9 的细菌酶在病毒感染过程中是如何在 RNA 序列的引导下识别和降解外源 DNA ，以及在动物和植物细胞中诱导位点特异性遗传改变的。通过结合单分子成像和大量的生化试验，该研究小组证实 Cas9 的基因组编辑能力是通过称作为“ PAM ”（ protospacer adjacent motif）的短 DNA 序列来实现的。

Jennifer Doudna（左） 与 Samuel Sternberg

该研究的领导者、生物化学家 Jennifer Doudna 说：“我们的研究结果揭示了 PAM 的两个主要功能，解释了它对于 Cas9 能够靶向和切割与导向 RNA 相匹配的 DNA 序列如此至关重要的原因。在外源 DNA 的靶向位点附近存在 PAM ，而宿主基因组的这些靶向位点则缺乏 PAM ，使得 Cas9 能够精确区分必须降解的非自身 DNA 和几乎完全相同的自身 DNA 。此外，存在 PAM 也是激活 Cas9 酶的必要条件。”

随着基因工程微生物，例如细菌和真菌，在绿色化学生产有价值的化学产品，包括治疗药物、高级生物燃料和生物降解塑料中发挥越来越大的作用， Cas9 正在成为合成生物学从业者一种重要的基因组编辑工具。

Doudna 说：“了解 Cas9 如何能在数百万到数十亿碱基对长的基因组中找出特异的20个碱基对的靶序列，或许能够改进在细菌和其他细胞类型中的基因靶向和基因组编辑工作。”

细菌微生物面临着来自病毒和称作为质粒的侵入核酸片段无休止的攻击。为了生存，微生物利用了一种基于核酸、以 CRISPR 遗传原件为中心的适应性免疫系统。通过结合 CRISPRs 和 RNA 导向的内切核酸酶，例如 Cas9 ，细菌能够利用专门的小 crRNA 分子，引导靶向及降解侵入病毒和质粒中的匹配 DNA 序列阻止它们复制。 CRISPR–Cas 免疫系统有三种不同的类型。 Doudna 和她的研究小组将焦点放在了II型系统上，其独特地依赖于 RNA 编程 Cas9 在靶位点上切割双链 DNA 。

论文的主要作者、 Doudna 研究组成员 Samuel Sternberg 说：“ Cas9 和 RNA 导向的相似复合物是如何在整个基因组中找出并识别匹配的 DNA 靶点，一直以来是 CRISPR–Cas 领域的一个大谜题，这是一个经典的大海捞针的问题。所有正在开发 RNA 可编程 Cas9 实现基因组操作的科学家们，都依赖于它能够在细胞内靶向独特的20个碱基对序列的能力。然而，如果 Cas9 只是在整个基因组的一些随机位点盲目地结合 DNA 直至撞到它的靶 DNA ，那这个过程将会非常费时，它有可能无法有效地实现细菌免疫，或成为一种基因组操作工具。我们的研究表明， Cas9 是通过首先寻找 PAM 序列来确定它的搜索范围。这加速了定位靶 DNA 的速度，最大限度地缩小了解读非靶向 DNA 位点的时间。”

Doudna 、 Sternberg 和同事们利用一种独特的 DNA 窗帘分析法和全内反射荧光显微术（Total inte RNA l reflection fluorescence microscopy TIRFM），在 Cas9 结合与解读 DNA 之时对单个 Cas9 进行了实时成像。 DNA 窗帘技术提供了前所未有的、关于 Cas9 靶点搜寻过程机制的一些新认识。采用传统的大量生物化学检测验证了成像的结果。

Sternberg 说：“我们发现 Cas9 只在识别 PAM 后才利用 RNA–DNA 碱基配对来解读 DNA 寻找匹配的序列，这样避免了意外地靶向细菌自身基因组中的匹配位点。然而，即使 Cas9 以某种方式与自身基因组中的一段匹配序列错误地结合，没有 PAM 也无法触发催化核酸酶的活性。利用这种 DNA 解读机制， PAM 提供了两个冗余的检查点，确保 Cas9 不会错误地破坏它自身的基因组 DNA 。”

原文检索：

Samuel H. Sternberg ,Sy Redding,Martin Jinek,Eric C. Greene& Jennifer A. Doudna. DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9. Nature, 29 January 2014; doi:10.1038/nature13011