生物芯片（DNA微阵列）荧光扫描仪中的激光共聚焦扫描技术

吴岚君

（北京放射医学研究所 100850）

　　所有的微阵列上的荧光须经荧光扫描装置来分析其上的荧光强度和分布，在这些装置中，激光共聚焦扫描仪具有优越的性能，能获取高质量的图像和数据，本文将分别介绍微阵列的相关特性和各种类型的微阵列扫描仪，激光共聚焦扫描仪的设计和关键特性，另外还将介绍一种已商品化的激光共聚焦荧光扫描装置。

　　微阵列是由分子整齐排列于固相表面，这些分子与荧光分子结合，测定荧光分子的强度后可推知结合分子的浓度。固相部分主要有经过表面化学处理的玻璃片如22mmχ75mm的载玻片。在微阵列上包被的分子常常能与多种荧光探针通过化学键相互作用而联结，通常情况下能联结两种荧光分子，例如在检测不同样品的基因表达的区别时，可将其中一样品（如正常组织）标记上发绿光的荧光分子，将另一种样品如肿瘤组织或发病组织标记上另一种发红光的荧光分子，用两种波长的激光激发微阵列上的样品，通过比较两种荧光在微阵列上某点的比例得知某类基因在两种组织中的差异。

　　微阵列上有样品组成的点阵，除了点之外，余下的是背景。如果玻璃片未经过表面化学处理，样品在玻片上结合不牢固，且容易扩散，造成背景高。若玻璃片经过表面化学处理后，点样的样品在微阵列上结合牢固，点的直径小，不扩散，从而点的密度增加，在进行荧光数据分析时，仪器将点上的荧光强度与点周围的背景强度相比较，如果背景中含有与荧光波段相一致的物质，则背景强度增高，样品的荧光信号将减弱，干扰信号的读取。

　　点阵上的点直径范围为25mm-500mm，通常目前能达到的直径为100mm±50，科学家们正在努力减小直径。因为点直径的变化对扫描结果的读取产生影响，如果点的直径大，荧光分子扩散的范围也大，则观察到的荧光强度相对较弱。

　　若在玻片上有灰尘或其它杂质如衣物纤维、皮屑、指纹等，扫描结果将受到影响。微阵列上的点干燥后形成很薄的层，使得激光共聚焦扫描成为可能，精心地调整扫描仪的焦距，可避免检测出不需要的背景杂质，包括微阵列上的灰尘、玻璃中自带的荧光杂质产生的干扰信号均可通过激光共聚焦的方式将其减少到最低程度。因为杂交因素影响，在微阵列上点与点之间的荧光强度差别很大。对微阵列扫描仪的要求要能够有较宽范围的灵敏度，通常来说，灵敏度调整范围为10000：1。

　　当荧光化合物或染料受到激光激发后将释放出荧光，在某一波长下有一最高释放强度。各种荧光化合物有各自特定的激发吸收值。如图1是FITC的波长对荧光激发强度曲线。从曲线图可见，在494纳米波长下，有一激发高峰，在518纳米下有一释放高峰，释放与激发高峰波长相差24纳米，这一现象在微阵列使用的染料中较普遍。两高峰波长的差值在专业上称之为Strokes shift, 初看曲线图人们可能会以为：FITC在510纳米的波长激发下，在475-510纳米范围内将释放部分荧光，其实并不尽然；释放波长一般情况下大于激发波长，在图中的激发曲线不是与释放曲线同时绘制的，将它们放在同一坐标图中是为了便于观看，其实它们是两套不同的数据。激发曲线的绘制过程如下：在单一长波长下，变换激发波长在不同波长下测定荧光释放强度，释放荧光曲线的绘制过程则是在最长激发波长下开始增加波长，测定在不同波长下的荧光释放强度。微阵列扫描仪设计者通过阅读和分析某中荧光染料的激发曲线和释放曲线来确定适合某种染料的复合扫描激发波长，该波长的激发效率至少要达到50-70%的水平。激发波长要避免太接近释放高峰对应的波长，否则荧光信号受到干扰。所以应在峰值的左边选择一激发波长。如对FITC来说，建议的激发波长在470-495nm.荧光释放强度在某一范围内，与激发光的强度成正比，当荧光释放达到最高峰后，增加激发光强度却不能提高释放强度，因为荧光释放已经达到饱和或光子将染料破坏淬灭。微阵列上各点的荧光分子受到激发后，从各个方向释放荧光光子，散射成球状，所以扫描仪须将这些散射的光子采集到，由于扫描仪的使用的是很低的释放光，几何球状是设计扫描设备的主要根据。

图1 FITC的波长对荧光激发强度曲线

　　微阵列扫描仪可有多种设计类型，但任何类型的微阵列扫描仪都有以下基本功能：

　　激发光

　　激发光的产生源有多种，如激光、氩灯、LEDs或钨丝灯。激发光的波长要避免将释放光的波长覆盖或重叠。对于LEDs或钨丝灯需用滤光器来选择某种特定波长的光。激光的波长单一不需要滤光器来选择某种特定波长的光。灯泡光源可产生多个波长的激发光，通过多个滤光器可选择多种特定的波长以满足激发不同荧光的需要。激发光应直接射向微阵列上的待测样品，通过大量一次照明的方式，待测样品的大部分区域同时受到激发，这种方式在CCD数码相机中较常见，该方式的缺陷是待测样品的受到得激发光不够均匀一致。这点是仪器设计者须考虑到的重要因数之一。另一种方式是：激发光聚焦于样品的很小部分，采用特定的光线采集和定位，聚焦点上的激发光光线密度较高，大约为10000watt/cm2。激发波长的选择是依据染料的激发曲线和释放曲线的峰值来确定的，在染料激发峰值的左边且激发效率较高的范围内，在某种染料水平下，激发效率越低，要达到某种光强，则需要向样品上发射的光越多。过多的发射光将通过光漂白作用破坏样品和污染干扰释放光的信号。

　　释放光采集

　　荧光由目镜的镜头来采集，该镜头聚焦于样品上并将一定区域内的光线收集到装置。收集的角度区域的大小非常关键，荧光释放是球形的，目镜对荧光的采集范围是决定仪器的采集效率关键指标之一。目镜采集光的角度由数值孔径来表示，图2表示了数值孔径与光采集效率之间的变化关系。当数值孔径为1.0时，目镜将收集到整个半球的光，相应的光采集效率为50%。在许多激光共聚焦微阵列扫描仪的数值孔径在 0.5-0.9, 而CCD-扫描仪的数值孔径为0.2-0.5。有其他类型的扫描仪不用目镜而是使用积分球面镜来采集释放的部分光源，但是部分光线经过多次球面反射而衰减。还有一些无散光收集装置，仅仅是将探测器放在样品的某一区域的上方，光线采集的效率受限于样品被照明处的范围及探测器的视角，例如，一个直径为25mm的探测器放在激发点上方100mm处，其实际的有效数值孔径为0.12。图2显示目镜的不同数值孔径与光采集效率的关系。

图2 目镜的不同数值孔径与光采集效率的关系

　　空间定位

　　是指对样品上的某一小区域上的荧光信号进行荧光强度计算，微阵列上的各点样品被分割为许多微小的像素，在进行荧光信号定量时，空间分辨率必须高于个点的大小，如微阵列上各点的直径为100mm，则像素的大小为5-20mm。空间定位可通过多元素探测器，如CCD或机械扫描装置。许多相机设置为大范围照明，探测器直接提供由许多像素组成的图象，该方法的缺陷是CCD提供的目镜数值口径较小，后方照明及维持系统冷却设备价值昂贵，由于光散射会导致像素之间交叉重叠造成信号不够清晰。机械扫描过程包括以下几个步骤：将激发光束聚焦于某一大小同像素差不多的点上，用单一元素的探测器采集那一小点上的释放光。要将整个样品扫描完全，则需移动样品或用一微小的反光镜使激光束移动扫描样品。虽然扫描装置增加了机械装置的复杂程度，但比起CCD相机来，机械扫描可达到的数值孔径更高，有更好的空间选择性，探测器也较便宜些。在低强度的光源下，高光线采集率是至关重要的。

　　激发/释放分辨

　　微阵列上各点的荧光释放强度通常要比激发光强度弱几个数量级，要从激发光中检测出微弱的荧光信号，就需要对这两种类型的光进行分离，由于光束中的光波长不相同，可利用光波分离将不同的光分开。许多装有目镜的扫描仪采用的是表面照明方式，激发光束与释放光束从样品到目镜经过同样的路径只是方向相反。这种途径使得从样品上反射和散射的光与荧光束混合在一起，所以需要用光束分离器对混合光进行分离。一种类型的光束过滤器是色彩二向或多向过滤器。它将激发光束反射并把释放光束以一较长的波长传输。这种滤光器对一、二或三种不同的激发/释放光都可进行较好的分离，但若超过四种以上的混合光束则分离有困难。另外一种类型的光线分离器称为几何光线分离器，如图3所示，在扫描系统中，目镜的数值孔径为0.6，像素的大小为10mm，从目镜出来的激发光束比释放光束细，一个小反光镜将激光束反射但是让环形部分的释放光束通过，其分离效果与波长光束分离器相同。从理论上来说，光束分离器可以完全将激发和释放光束分开，但实际上并非如此，通常在探测器前放滤光片过滤释放光束。这些滤光片只允许染料的释放高峰附近很窄的一段波长的光通过，而其他波长的光包括激发光都被阻挡了。这是微阵列扫描仪必需的的第二道光束分离装置。有的扫描仪不用光束分离器而是将激发光束和释放光束放在不同的轴上。该方法能将释放光路径的激发光发射回去，但却难以达到较高的数值孔径，因为目镜离样品很近，通常小于1毫米，所以激发光束能进入目镜的角度范围很小。其他具有区分不同波长光束的装置有棱镜、光栅等，这些装置还可产生一些特殊的作用如连续的光波调谐功能。然而，在微阵列中，由于要求对激发光有高度的敏感性，因而对释放光装置也相应要求有很高的精密度。

图3 在上位照明扫描仪中的光束分离器

　　检测荧光扫描仪的探测器

　　将微弱的荧光信号转化为电信号,在微阵列扫描仪中的光线探测器有：光电倍增管、CCD点阵探测器、雪崩光电二极管。各种装置有其优点也有其缺点。不同检测范围的仪器要根据它们各自的特点来选择合适的探测装置。光电倍增管在可见光波范围内是最灵敏的探测器，它属于单点探测器并要求扫描系统对微阵列上的样品进行空间定位，通过改变电压可以很方便地改变光电倍增管的灵敏度。光电倍增管的灵敏度在红外及近红外波长范围内降低得很快，所以它们的用途主要限制在可见光波长范围内。CCD对微弱信号的放大功能不及光电倍增管，因而需要额外的放大系统来将信号放大才能达到光电倍增管的灵敏度范围的上限。其主要的缺点是：CCD探测器的实际数值孔径难以达到06-09的范围,在低亮度背景下,限制微弱信号被检测出来, 另外CCD探测器不能与共聚焦系统相兼容;但是在高亮度背景下, 因为CCD探测器有内置式扫描功能,其优越性就体现出来了。

　　所有的微阵列扫描仪都有固定和放置微阵列固相基质的装置，我们称之为扫描仪的载样盒。载样盒要有能够容纳下玻片的空间，组成其的材料应能经受的住上千次取放样品的刮擦考验。通常微阵列的固体介质为显微载玻片，还有塑料片，但是塑料片不如玻璃片刚硬，容易变形，不易聚焦准确，所以多数研究者使用的是显微载玻片。扫描检测时通常是在室温下进行，此时玻片上各点样品已经干燥，然而，有些染料如FITC在潮湿的环境下才能释放出强烈的荧光，所以研究者们在待测样品上滴加适量的缓冲液，然后盖上盖玻片进行观察。这就需要载样盒能够容纳载玻片与盖玻片叠加之后的厚度，扫描仪在扫描时聚焦于盖玻片下的那一层平面进行扫描。

　　以下要介绍共聚焦扫描微阵列的工作原理，顾名思义，共聚焦扫描仪将视野中的两个聚焦点的影象装配为二维图象，工作过程如所示：平行的激光束通过光束分离器后进入目镜，目镜采集到部分球状散射的荧光释放光并使这些光成为平行的光束，此外还采集被反射的激光，这些激光的强度要比荧光强度大3-7倍。采集回来的光束再次通过光束分离器，光束分离器将大部分激光反射回激光源处，并允许大部分荧光束通过光束分离器，一面平面镜将荧光束反射到释放光栅处，光栅选择很窄范围波长的光通过，并将剩余的激光激发光全部反射回去。共聚焦的工作特点体现在探测目镜和开了一个针孔大的孔的光线挡板上，探测目镜将平行光聚集为很小直径的一束光之后，挡板上的小孔只允许聚焦的光线通过并将其余的光遮挡住。图5显示若发光点不在目镜焦点范围内，则光线将被探测目镜聚集于挡光板前，散射之后大部分光线被遮挡了，只有焦点范围内的光线才能有效地进入当光板的小孔被探测器检测到。对焦距范围的严格限制使得灰尘或近表面的小颗粒均不能成像被探测到，因而共聚焦扫描仪获得图象的信噪比要高于非共聚焦扫描装置。但另一方面，对焦距范围的严格限制要求载玻片摆放非常平稳，扫描运动过程中载样盒要保持在同一水平面上，偏差要小于焦距的范围，偏差小于±10mm。这一要求增加了机械加工的精密度，使得加工工艺更加复杂，但这是保证获得最佳图象质量的有效途径之一。