表达蛋白的分离与纯化 一、可溶性产物的纯化(融合T7·Tag的表达蛋白) (一)试剂准备 采用T7· Tag Affinity Purification Kit 1.T7·Tag抗体琼脂。 2.B/W缓冲液:4.29mM Na2HPO4,1.47 mM KH2PO4,2.7 mM KCl,3. 0.137mM NaCl,1%吐温-20,pH7.3。 4. 洗脱缓冲液: 0.1M柠檬酸,pH2.2。 5. 中和缓冲液:2M Tris,pH10.4。 1. PEG 20000。 (二)操作步骤 1.100ml 含重组表达质粒的菌体诱导后,离心5000g×5min,弃上清,收获菌体,用10ml预冷的B/W缓冲液重悬。 2. 重悬液于冰上超声处理,直至样品不再粘稠,4℃离心 14000g×30min,取上清液,0.45μm膜抽滤后作为样品液。 3. 将结合T7·Tag抗体的琼脂充分悬起,平衡至室温,装入层析柱中。 4. B/W缓冲液平衡后样品液过柱。 5. 10ml B/W缓冲液过柱,洗去未结合蛋白。 6. 用5ml洗脱缓冲液过柱,每次1ml,洗脱液用含150μl中和缓冲液的离心管收集,混匀后置于冰上,直接SDS-PAGE分析。 7. 将洗脱下来的蛋白放入透析袋中,双蒸水透析24hr,中间换液数次。 8. 用PEG 20000浓缩蛋白。 (三)注意事项 蛋白在过层析柱前,要0.45μm膜抽滤,否则几次纯化后,柱子中会有不溶物。 二、包涵体的纯化 包涵体是外源基因在原核细胞中表达时,尤其在大肠杆菌中高效表达时,形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白质颗粒,在显微镜下观察时为高折射区,与胞质中其他成分有明显区别。包涵体形成是比较复杂的,与胞质内蛋白质生成速率有关,新生成的多肽浓度较高,无充足的时间进行折叠,从而形成非结晶、无定形的蛋白质的聚集体;此外,包涵体的形成还被认为与宿主菌的培养条件,如培养基成分、温度、pH值、离子强度等因素有关。细胞中的生物学活性蛋白质常以可融性或分子复合物的形式存在,功能性的蛋白质总是折叠成特定的三维结构型。包涵体内的蛋白是非折叠状态的聚集体,不具有生物学活性,因此要获得具有生物学活性的蛋白质必须将包涵体溶解,释放出其中的蛋白质,并进行蛋白质的复性。包涵体的主要成分就是表达产物,其可占据集体蛋白的40%~95%,此外,还含有宿主菌的外膜蛋白、RNA聚合酶、RNA、DNA、脂类及糖类物质,所以分离包涵体后,还要采用适当的方法(如色谱法)进行重组蛋白质的纯化。 (一)试剂配制 1.缓冲液A:50mM Tris-HCl(pH8.0),2mM EDTA,100mM NaCl。 2.缓冲液B:50mM Tris-HCl(pH8.0),1mM EDTA,100 mM NaCl,1%NP-40。 3.缓冲液Ⅰ:50mM Tris-HCl (pH8.0),2mM EDTA,100 mM NaCl,0.5%Triton X-100(V/V),4M脲素。 4.缓冲液Ⅱ:50M Tris-HCl(pH8.0),2mM EDTA,100 mM NaCl,3% Triton X-100 。 1.缓冲液Ⅲ:50mM Tris-HCl(pH8.0),2mM EDTA,100 mM NaCl,0.5%Triton X-100,2M 盐酸胍。 5.缓冲液C:8M脲素,10mMβ-巯基乙醇,100 mM Tris-HCl(pH8.0),2mM EDTA及脱氧胆酸钠。 (二)操作步骤 1.用缓冲液A漂洗菌体细胞(10ml/g), 离心6000g×15min,收集菌体细胞,重复此步骤,将菌体细胞再在缓冲液A中洗涤一次。 2.将漂洗过的菌体细胞悬浮于缓冲液B中,超声破碎,镜检,破碎率高于95%,离心1500g×30min,收集包涵体沉淀。 3.将包涵体沉淀用缓冲液Ⅰ、缓冲液Ⅱ、缓冲液Ⅲ分别超声洗涤一次,1500g 离心收集包涵体沉淀。 4.包涵体的溶解:用含高浓度脲素的缓冲液室温放置30min,然后离心1500g×30min,留上清。将溶解后的蛋白质适当稀释,磁力搅拌,透析过夜。 5.溶解后的包涵体蛋白可通过亲和层析进一步纯化。 (责任编辑:泉水) |