用随机引物法标记的DNA探针或cDNA探针比活性显著高于缺口平移法，且结果较为稳定。这种方法尤其适用于真核DNA探针，因为随机引物来自真核DNA，其与真核序列的退火率要高于原核序列。因此，对于克隆的DAN探针，常先将插入探针DNA切下来回收后再标记，而缺口平移法可直接用于全质粒的标记。

　　5．聚合酶链反应（详见第二十二章）　聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）是一种分子生物学新技术，由美国Cetus公司人类遗传学部的Kary.B. Mullis于1985年创立。该技术利用两个与相反链杂交并随着于靶DNA两侧的寡核苷酸引物经酶促合成特异的DNA片段，包括模板变性，引物退火和引物延伸三个步骤的反复循环，最终两引物所夹靶DNA得到千万倍以上的扩增。因此 ，PCR技术已成为一项极为有价值的技术并已迅速推广应用。

　　PCR技术有许多重要用途，其中之一便是可用来标记高比活性DNA探针。PCR技术具有很高的特异性，可在1～2h之内在量合成探针DNA片段，如果在底物中加入[α-32P]dNTP或其它标记的dNTP，则探针DNA合成过程中可得到很好的标记，标记物的掺入率可高达70%～80%。因此，PCR标记技术特别适用于大规模检测和非放射性标记。该法的缺点是要合成一对特异性PCR引物。使用从探针DNA上制备的小片段作引物也能取得较好的标记效果。

　　（二）核酸探针的非放射性标记技术

　　1．光敏生物素标记核酸　目前使用的光标生物素试剂有两种：光生物素（乙酸盐）和补骨脂素生物素。它们都是由一个光敏基团、一个连接臂和一个生物素基团组成。光生物素的光敏基团是-N3，它在光作用下可与核酸中的碱基结合。补骨脂素生物素中的光敏基团补骨脂素在光照（320～400μm）下，可与单链或双链核酸发生反应，反应主要在T上，C上也有一定程度的反应。光敏生物素的连接臂含6～12个碳原子，用以减少探针杂交时的空间位阻。光敏生物素标记核酸，方法简单，灵敏度也可达到pg水平，可用于外源基因的检测。最近出现了一种新的光敏活性DNA生物素试剂，即生物素-聚乙二醇-当归素（BPA）。BPA的DNA结合部分是一个活性糖香豆素衍生物，在长波UV下它可与DNA碱基共价键结合。BPA反应物与DNA结合比光敏生物素更特异，在可见光下它不与核酸反应，这个特性可使BPA只标记粗制细胞裂解物中的核酸，而不标记蛋白、多糖和其他细胞大分子。

　　2．酶促生物素标记核酸　以生物素化的脱氧核苷三磷酸（Bio-11-dUTP,Bio –7 – dATP、Bio-11-dCTP）等代替相应32P标记的脱氧核苷三磷酸，经DNA聚合酶作用掺入DNA。Bio-dUTP代替dTTP,Bio-dATP代替dATP，Bio- dCTP代替dCTP。Bio –11-dUTP的11是指生物素基团与脱氧核苷酸之间连接臂的碳链长度。常用的酶促生物素标记DNA的方法有缺口平移法和随机引物延伸法。

　　3．寡核苷酸的生物素末端标记　有5’-磷酸的化学标记法和3’-OH的酶促标记法。前者将寡核苷酸的5’-磷酸接上一个乙二胺，然后用琥珀酰亚胺生物素，将生物素基团连接在磷酸酰胺基上。后者是用末端转移将Bio-11–dUTP加于其3’-OH端（脱去一个焦磷酸）。

　　4．酶标DNA　标记试剂是辣根过氧化酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）。通过对苯醌（PBQ）与聚乙烯亚胺（PEI）连接而成（HRP-PBQ-PEI+），此试剂在戊二醛的作用下与变性的DNA结合，使HRP与DNA连接在一起，组成HRP标记的DNA探针。

　　5．酶标寡核苷酸　包括核苷酸5’末端标记HRP法和内部标记AP法。前者是在HRP中产生一个-HS反应基团，在寡核苷酸合成终了加在5’端，带一个C6的-HS基，与活化的HRP反应生成5’-HRP寡核苷酸。后者是在全成寡核苷酸过程中将一个5’带连接臂及CF3基团的尿苷3’亚磷酰亚胺合成在寡核苷酸链中，合成后此活化的寡核苷酸与AP反应即得到AP标记的寡核苷酸。

　　6．DNA半抗原标记　其原理与Bio-11-dTUP相同，只是用毛地黄甙代替生物素形成Dig –11- dUTP，酶促掺入DNA分子。用抗毛地黄甙抗体检测标记在DNA上的半抗原分子Digoxigenin（地高辛）

　　(三）非放射性探针的显示体系

　　1．AP显色体系

　　BCI –OH+NBT→紫色↓

　　ASO：等位基因特异的寡核苷酸，BCIP：5溴-4氯-3吲哚磷酸，NBT：四氮唑蓝，Pi：磷酸。

　　2．HRP显色体系

　　HRP + H2O2[HRP·H2O2]

　　ODA –NH2 +[HRP ·H2O2]棗→ODA-N = ODA/棕色↓+HRP +H2O

　　ODA：邻-联茴香胺。

　　3．ABC显色体系

　　DNA –B + SA – AP→DNa – B – SA或DNa – B +SA - BAP→DNa –B –SA –BAP

　　经上述两反应，把AP连接在DNA上以后，再进行AP酶显色。这里SA为Streptavidin（链酶亲合素），BAP为生物素化的磷酸酶，B为生物素（biotin），ABC为Avidin – Biotin - Enzyme com－plex, 即亲合素- 生物素-酶复合物。

　　以上反应AP亦可用HRP代替。

表18-3曱核酸探针的标记分子

　　* ：NT：缺口平移； PCR：聚合酶链反应；RPL： 随机引物标记； TL：末端标记

　　4．非放射发光自显影　　若将AP或HRP的显色底物根据光化学原理换成一种酶解后产生光子的化合物，可用自显影技术暴光X线片显示。

　　（1）HRP发光自显影：氨基苯-甲酰肼在HRP与H2O2的作用下氧化为氨基苯二甲酸，同时放出N2及发光（波长428nm）。发光时加入某些酚的衍生物时可增强发光上千倍。反应如下图：

　　（2）AP的发光自显影：AP的发光底物是金刚烷二氧丁环磷酸盐（AMPPD），它含有磷酸酯键在AP的作用下水解下一个磷酸，进而由分子内过氧键提供能源分解产生金刚酮和激发态的甲基间-氧苯甲酸阴离子，当此阴离子恢复到基态时发出光子。可用波拉黑白片（621型）直接暴光显影。显影信号强度比BCIP/NBP显色法强两上数量级。是很前景的显示体系。

　　其发光反应的原理如下：

　　HRP的发光原理：

　　AP的发光原理：

　　五、核酸分子杂交的类型

　　随着基因工程研究技术的迅猛发展，新的核酸分子杂交类型和方法在不断涌现和完善。核酸分子杂交可按作用环境大致分为固相杂交和液相杂交两种类型。固相杂交是将参加反应的一条核酸链先固定在固体支持物上，一条反应核酸游离在溶液中。固体支持物有硝酸纤维素滤膜、尼龙膜、乳胶颗粒、磁珠和微孔板等。液相杂交所参加反应的两条核酸链都游离在溶液中。

　　由于固相杂交后，未杂交的游离片段可容易地漂洗除去，膜上留下的杂交物容易检测和能防止靶DNA自我复性等优点，故该法最为常用。常用的固相杂交类型有：菌落原位杂交、斑点杂交、狭缝杂交、Southern印迹杂交、Northern印迹杂交、组织原位杂交和夹心杂交等。

　　液相杂交是一种研究最早且操作复合的杂交类型，在过去的30年里虽有时被应用，但总不如固相杂交那样普遍。其主要原因是杂交后过量的未杂交探针在溶液中除去较为困难和误差较高。近几年由于杂交检测技术的不断改进，商业性基因探针诊断盒的实际应用，推动了液相杂交技术的迅速发展。下面对固相杂交和液相杂交分别进行介绍。

　　（一）固相膜核酸分子杂交方法

　　固相核酸杂交多是在膜上进行，因此，以下主要介绍固相膜的核酸分子杂交方法：

　　1．DNA的变性　DNA变性解链是杂交成功的关键。Southern印迹杂交时DNA在凝胶中变性，变性方法是将凝胶浸在数倍体积的1.5mol/l NaCl和0.5mol/l NaOH中1h然后用数倍体积的1mol/l Tris –HCl(Ph8.0)和1.5mol/l NaCl溶液中和1h。DNA受酸、碱、热等处理均能发生变性，但强酸会使核酸降解。一般认为碱变性较好，可避免DNA降解。热变性在要低DNA浓度（100μg/ml）和低盐浓度（0.1mol/l SSC 含15mmol/l NaCl - 1.5mmol/L柠檬酸三钠，pH7.0）下进行。用SSC稀释DNA溶液为50μg/ml,加10mol/l NaOH使最终浓度为0.1mol/L（pH约12.8），室温变性10min，很快置冰盐水中，用10min/l HCl或5mol/l NaH2PO4调pH到7～8[亦可用碱变性后，调至中性，再加热100。c 10min]，DNA变怀可用OD260增加（约30%～40%）来检测，变性DNA醇沉淀呈雪样，完全失去纤维状沉淀。变性后加入等量冷的12×SSC，冰浴保存。

　　2．变性DNA在硝酸纤维素膜上的固定　硝酸纤维素滤膜（孔径0.45μm）先在蒸馏水中充分浸泡，再用6×SSC浸泡30min～2h，凉干。DNA样品转移或加至硝酸纤维素膜上后，先室温干燥4h，然后在80。C真空干燥2h。

　　3．预杂交　湿润的滤膜放入可加热封口的塑料袋中，按每平方厘米滤膜加0.2ml预热至60。C的预杂交液（6×SSC，0.5%,SDS,5×Denhardt液，100μg/ml鲑鱼精DNA）。鲑鱼精DNA需经过剪切和DNA酶消化处理，然后酒精沉淀纯化，调浓度至10mg/ml，用前放100。C水浴中煮沸变性10min，冰水骤冷。尽可能将袋中气泡赶尽，可封口器将袋口封住。将杂交袋浸入68。C水浴保温3~12h。当预杂交液温度升至68。C时，在滤膜表面常会形成小气泡。轻轻晃动袋中液体即可除去这些小气泡，这一点对于保证滤膜表面充分浸润预杂交液很重要。

　　4．杂交　从水浴中取出塑料袋，用剪刀剪开一角，尽可能挤净预杂交液。用吸管或大枪头将杂交液加入袋中，用恰好是足量的液体保持滤膜湿润（50μl/cm2）。溶液的组成是6×SSC，0.01mol/l EDTA, 变性的标记核酸探针，5×Denhardt液，0.5%SDS, 100μg/ml变性的鲑鱼精DNA。尽可能赶尽气泡后，将塑料袋严密封口，杂交反应在68℃水浴中进行，所需时间视探针和检测靶DNA的性质及探针的比活性等情况而定，一般4～20h。