第二节　细胞因子的结构和生物学特征

　　由于基因工程技术的迅速发展，许多细胞因子的cDNA克隆获得成功，并获得了高活性基因表达产物，这给细胞因子的细胞生物学和分子生物学的研究提供了必要的前提。目前已有IL-2、EPO、G-CSF、GM-CSF、IFN-γ和IFN-α等细胞因子投放市场，有更多的细胞因子正在进行不同期的临床验证。细胞因子在正式投入市场成为商品前，必须经过临床前筛选实验、临床Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期试用等几个阶段的验证。

　　一、白细胞介素（IL）

　　在1979年第二届国际淋巴因子专题讨论会上，将来自单核-巨噬细胞、T淋巴细胞所分泌的某些非特异性发挥免疫调节和在炎症反应中起作用的因子称为白细胞介素（interleukin，IL）。目前已知许多IL是来自单核-巨噬细胞和淋巴细胞以外的其它细胞。已正式命名的白细胞介素有IL-1～IL-15。

　　（一）IL-1

　　IL-1是一种单核因子。1972年Gery等发现人白细胞培养的上清中含有一种可溶性物质，这种物质可促进小鼠胸腺细胞对植物血凝素（PHA）的有丝分裂反应。起初命名为淋巴细胞激活因子（lymphocyte-activating factor,LAF)或内源性热原质（endogenous pyrogen)、破骨细胞激活因子（osteoclast activating factor)、黑素瘤细胞生长抑制因子（melanoma growth inhibitory factor)等，1979年国际统一命名为IL-1。

　　1.IL-1的产生　IL-1可由多种细胞合成和分泌。

　　（1）单核细胞、巨噬细胞（如腹腔粘连细胞peritoneal cell,PC)、树突状细胞等在摄取抗原抗体复合物后或在抗原提呈过程中可产生IL-1。在大多数刺激剂刺激外周血单个核细胞（PBMC)条件下，IL-1βmRNA水平要高于IL-1αmRNa 20～25倍。

　　（2）小鼠巨噬细胞细胞系P388D1、J774、PU5-1.8、WEHI-3以及人前单核细胞株U937等在脂多糖（LPS）刺激后都能分泌大量的IL-1。

　　（3）表皮细胞、NK细胞、B细胞、成纤维细胞、内皮细胞、脑胶质星状细胞、肾小球系膜细胞（mesangial cell）、滑膜衬里细胞（synovial lining cell）、平滑肌细胞、上皮细胞、胎盘细胞、白血病细胞、PMN等在某些条件下亦可产生IL-1。

　　许多因素可以直接影响单核-巨噬细胞IL-1的分泌：①细胞因子如巨噬细胞激活因子（MAF）、集落刺激因子（CSF）、IFN-α、IFN-γ对IL-1产生具有增强作用。②LPS、PPD、BCG和李斯特菌，葡萄球菌、链球菌外毒素，活病毒等也是IL-1产生的刺激剂。在外周血中20pg/ml内毒素刺激单核细胞即可产生IL-1，因此在一般培养条件下，由于微量内毒素的污染可刺激单核细胞分泌IL-1。10ng/mlLPS可使单核细胞合成IL-1增加100倍。③蛋白激酶C（PKC）的激活剂乙酸肉豆蔻佛波醇（phorbol myristate acetate,PMA)以及钙离子载体（calcium ionophore)如A23187均具有强烈的刺激作用。④皮质类固醇和前列腺素则对IL-1的产生有抑制作用。

　　2.IL-1的分子结构和基因　完整的人IL-1α和IL-1β基因组分别为10.5kb和7.8kb。人和小鼠IL-1基因定位于2号染色体，均含7个外显子。IL-1前体(ProIL-1)为31kDa，通过蛋白水解酶裂解形成成熟的IL-1分子。IL-1在不同种属中有较高同源性。在氨基酸水平上，IL-1α和IL-1β在不同种属同源性分别为60%～70%和75%～78%；但在同一种属中IL-1α与IL-1β同源性只有25%。人IL-1α（PI5.0）和IL-1β（P17.0）分别由159和153个氨基酸残基组成，分子量约17.5kDa，同源性为28%。IL-1对糜蛋白酶敏感。不同细胞所产生IL-1的等电点可有所差异。

　　3.IL-1的受体　T细胞、成纤维细胞表面IL-1受体为80kDa，而B细胞则为68kDa。编码这两种IL-1受体是不同基因产物。P80IL-1R称为IL-1RtI（CDw121a),P68IL-IR称为IL-1RtⅡ（CDw121b)。

表4-1　IL-1 Rt Ⅰ和IL-1RtⅡ的比较

　　（1）IL-1RtⅠ：IL-1RtⅠ cDNA克隆在人和鼠均已获得成功。IL-1RtⅠ为穿膜蛋白，胞膜外区有3个结构域属免疫球蛋白超家族，穿膜区有20个氨基酸残基，胞浆区含有丝氨酸和苏氨酸残基，当IL-1与IL-1RtⅠ结合后丝氨酸和苏氨酸很快被磷酸化。通过基因转染Hela细胞实验证明，IL-1RtⅠN端2个结构域与配体结合有关。针对N端17个氨基酸片段的McAb能阻断IL-1RtⅠ与IL-1结合。IL-1与IL-RtⅠ结合后即发生内化（internalization)。成纤维细胞、平滑肌细胞主要表达IL-1RtⅠ。一般来说，IL-1RtⅠ可与IL-1α和IL-1β相结合，但IL-1α与Ⅰ型受体结合能力较高，而IL-1β与Ⅱ型受体结合较高。IL-1与不同种属不同细胞结合后的生物学效应有所差别，如人和鼠IL-1α结合到人内皮细胞上的亲和力相同，但产生的生物学效应不完全相同。抗IL-1RtⅠMcAb在体内和体外均可抑制IL-1在生物学效应。

　　（2）IL-1RtⅡ：主要分布于EBV转化的B细胞、Raji细胞、巨噬细胞、胎盘、Th2克隆、活化T细胞、PMN和骨髓细胞等。胞膜外区有3个结构域属免疫球蛋白超家族，与IL-1RtⅠ之间有28%氨基酸同源性，穿膜区有更高的同源性，但胞浆区要比Ⅰ型受体短，可能在介导信号传递上有差别。IL-1与IL-1RtⅡ结合后易发生降解而不象IL-1RtⅠ那样发生内化。IL-1RtⅡ经蛋白水解酶水解后可形成可溶性的IL-1结合蛋白（soluble IL-1 binding protein,sIL-1BP)，46kDa，与IL-1β有较高亲和力，在自然情况下sIL-1BP是IL-1β的抑制剂。可溶性IL-1R（soluble IL-1 receptor,sIL-1R)可有效防止小鼠心脏移植排斥反应，减轻Lewis大鼠的实验性关节炎和过敏性大脑炎。

　　在T细胞中，CD4阳性细胞亚群IL-1受体表达要高于CD8阳性T细胞亚群。以小鼠胸腺瘤细胞系EL-4为模型，发现IL-1α和IL-1β可结合到相同的高亲和力受体。现已发现联合免疫缺陷病人的T细胞表达IL-1R缺陷，对抗原刺激不发生增殖反应，也不产生IL-2，病人易患机会致病菌感染。

　　4.IL-1受体拮抗物　在某些白血病患者血清和尿中以及单核细胞培养上清中发现一种多肽性质的IL-1特异性抑制因子，称为IL-1受体拮抗物（interleukin 1 receptor antagonist,IL-1ra),又称IL-1受体拮抗蛋白（IL-1 receptor antagonist protein, IRAP)。

　　（1）IL-1ra的产生：IL-1ra体外可由LPS刺激的单核细胞，PMA、PHA、CSF刺激的单核细胞系产生。

　　（2）IL-1ra分子的结构和基因：IL-ra基因克隆1990年获得成功，编码人IL-1α、IL-1β和IL-1ra基因都定位于2号染色体。IL-1ra cDNA编码的多肽为17kDa，糖基化后分子量为25kDa，但糖基对IL-1ra活性并非必需。未成熟的IL-1ra分子为177个氨基酸残基的肽链，N端25个氨基酸多为疏水性氨基酸，构成典型的信号肽顺序。成熟分子由152个氨基酸残基组成。在65、68、116及122位上有4个保守的半胱氨酸残基，Cys65-116，Cys68-122间形成链内二硫键。从cDNA推算的氨基酸序列IL-1ra与IL-1α和IL-1β分别有19%和26%的同源性，人和小鼠的IL-1ra有77%同源性。

　　（3）IL-1ra的生物学作用：IL-1ra能特异性地抑制T细胞表面IL-1R与IL-1结合，但不抑制TNF或IL-2与相应受体的结合。IL-1ra不与IL-1直接结合，而是一种IL-1与IL-1R相互结合的竞争性抑制物。rIL-1ra与Ⅰ型和Ⅱ型IL-1R都能结合，但与IL-1RtⅠ结合的亲和力要高于与IL-1RtⅡ结合的亲和力。rIL-1ra、rIL-1α、rIL-1β与IL-1RtⅠ结合的亲和力比较相近，但rIL-1ra、rIL-1α与IL-1RtⅡ结合的亲和力要低于rIL-1β与IL-1RtⅡ结合的亲和力。IL-1ra能抑制IL-1刺激滑膜细胞PGE2的产生和软骨细胞胶原酶合成，抑制胸腺细胞的增殖以及中性粒细胞、嗜酸性粒细胞与内皮细胞的粘附。在体内可抑制IL-1引起的发热。IL-1ra可结合T细胞和成纤维细胞表面IL-1RtⅠ,也能抑制IL-1与PMN、B细胞、髓样单核细胞白血病细胞IL-1RtⅡ的结合。IL-1ra可抑制PBMC、骨髓细胞衍生的髓样淋巴细胞白血病细胞自发增殖和自发产生IL-1、IL-6和GM-CSF。在体内，IL-1ra可阻止LPS引起的家兔死亡，减轻免疫复合物所诱导的炎症，抑制小鼠骨髓移植后GVHR的发生，提高存活率，此外，还可防治动物实验性溃疡性结肠炎。

　　（4）IL-1ra与临床：正常人血清IL-1ra水平在200pg/ml以下，感染、炎症以及内毒素血症病人血清中IL-1ra水平可升高到8ng/ml。应用IL-1ra治疗败血症已进入Ⅲ期临床验证，死亡率明显下降。此外IL-1ra治疗类风湿性关节炎也已开始在临床验证。IL-1ra在体内的副作用很小，但应用剂量较大，阻断IL－1　50%生物学效应时所用IL-1ra的用量是IL-1用量的10～500倍。

　　5.IL-1的生物学作用　IL-1具有广泛的免疫调节作用，并有致热和介导炎症的作用，它的生物学功能是通过与相应高亲和力受体结合而介导的，IL-1生理条件下的浓度仅在10^-12～10^-14M之间。IL-1作用无明显的种属特异性，人IL-1可作用于小鼠源性的细胞。主要表达IL-1RtⅡ的细胞似乎比表达IL-1RtⅠ细胞相对有种属特异性。

　　（1）促进胸腺细胞、T细胞的活化、增殖和分化：T细胞经抗原、有丝分裂原或抗TCR/CD3刺激后表达IL-1受体，在IL-1作用下T细胞被活化，由G₀期进入G₁期。活化后的T细胞分泌IL-2、IFN-γ、GM-CSF、IL-4等细胞因子，并表达IL-2受体进而T发生增殖和分化。IL-1还可增加T细胞表面MHCⅡ类抗原的表达。IL-1能诱导杀伤性T淋巴细胞（CTL）的分化，在混合淋巴细胞培养（MLC）中，IL-1诱导CTL的产生可能是通过促进T细胞分泌IL-2和IFN-γ。IL-6可协同IL-1活化T细胞和刺激IL-2的产生。

　　（2）促进B细胞功能：协同IL-4等细胞因子刺激B细胞的增殖和分化，促进免疫球蛋白的合成和分泌，这种作用可能是通过IL-1诱导PBMC产生IL-6而介导的。

　　（3）刺激骨髓多能干细胞的增殖：现已证实IL-1与Stanley(1986)报道的血细胞生成素-1（hemopoietin-1)是同一种分子。IL-1刺激造血细胞和成纤维细胞产生CSF，增加造血细胞CSF受体的数量，并协同IL-3、IL-6、G-CSF、M-CSF、GM-CSF、SCF等因子刺激造血功能，对粒单系祖细胞和巨核系祖细胞均有刺激作用。此外，IL-1可刺激干细胞产生SCF，IL-1本身可作用早期干细胞，激活干细胞从Go期进入增殖周期。IL-1能预防化疗造成的骨髓抑制已进入临床Ⅱ期验证。

　　（4）增强NK细胞的杀伤活性：通过提高NK细胞对IL-2等细胞因子的敏感性增强其杀伤活性，IL-1与IL-2或IFN有协同刺激NK细胞活性的作用。

　　（5）促进多种免疫分子的基因表达：如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、TNF-α、TNF-β、INF-β、G-CSF、GM-CSF、GM-CSF，IL-2Rα链（Tac)，补体C2、Bf，粘附分子以及c-fos、c-myc和c-jun等原癌基因的表达。C-fos和C-jun组成活化蛋白-1（AP-1），活化IL-2基因的启动子，诱导B细胞κ链核因子（NF-κB）活化免疫球蛋白κ链基因，诱导NF-IL-6转录因子活化IL-6启动子。

　　（6）刺激单核细胞和巨噬细胞产生IL-6和TNF，并通过单核细胞和巨噬细胞产生IL-8介导对中性粒细胞的趋化作用。此外，IL-1诱导内皮细胞活化，刺激中性粒细胞释放炎症蛋白和炎症介质，直接参与炎症发生过程。