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关于钙成像系统(2)

时间:2005-10-12 15:11来源:本站原创 作者:giant 阅读:

注3:测荧光强度时,为排除背景的干扰,校正R=(F340-Fb) / (F380-Fb)。其中,Fb是细胞背景的荧光强度,Simple PCI软件可直接扣除背景的荧光强度,计算校正后的R值。

二、校正Rmin、Rmax和β值。

方法:利用体内校正Kd的Rmin、Rmax和β值。

三、Fura-2/ AM负载入细胞

1.     小心取出培养有细胞的培养皿,用负载溶液I轻轻漂洗3次;生长面朝上,在上面分别滴加负载溶液II(Fura-2/ AM染液的终浓度为2ug/ml);

2.     将细胞放置于37℃细胞培养箱中,避光负载20-30min,

3.     用负载溶液I冲洗细胞1-3次,将细胞放置在37℃(25度或室温)下避光孵育, 20-30min。制片,待检。

4. 结合Calcium Fura-2检测参数:Ex=340nm, Em=510 nm;游离Fura-2检测参数:Ex=380nm, Em=510nm。

注1:具体操作可结合实际给药操作,适当调整。

注2:负载用的细胞培养皿,经多聚赖氨酸处理有利于细胞贴壁和生长。

    多聚赖氨酸处理的步骤:将无菌的浓度为1mg/ml的多聚赖氨酸Tris缓冲溶液(0.15mol/L,PH 8.4)约0.25ml滴在洁净无菌的培养皿底部过夜,使多聚赖氨酸粘附在培养皿底部。第二天吸去多余的多聚赖氨酸溶液,依次经去离子水、Tyrode溶液和去离子水浸洗两次。空气干燥并用紫外光照射15分钟后即可使用。

 

四、Fura-2/AM负载培养细胞的瞬间胞内钙动态变化的测量

将待检样品放在显微镜载物台上观察,通过Hamamatsu钙离子检测系统(Hamamatsu AG CCD+SimplePCI软件系统+Zeiss Axiovert200倒置荧光显微镜)进行实时监测测定。在相同的环境下(同一光学系统、同一温度、恒定的曝光时间等)340nm和380nm间激发成像,测定一定时间序列胞内钙离子的荧光强度F340、F380、Ratio和钙离子浓度的变化。

注:1. R值也是校正后的Ratio=(F340-Fb) / (F380-Fb)。

    2. 先测静息状态的钙离子浓度,待其值稳定后,可对给药细胞检测钙离子的浓度变化情况。

 

五.成像系统实时检测过程与数据处理

1)  通过软件设置CCD、DG-4的控制参数:设定340nm、380nm滤光片自动切换时间、曝光时间等。

2)  在电脑上成像后,建立背景ROI,计算背景光密度值Fb以扣除背景。

3)  通过软件自动识别细胞样品,建立样品ROI区域。

4)  自定义计算参数F340、F380、R= (F340-Fb) / (F380-Fb)、[Ca 2+]i =KD x ß x (R -Rmin)/(Rmax- R)。

实时输出细胞340/380nm的荧光光密度比率变化曲线图和游离Ca2++的浓度变化曲线图 ,并存储数据。

仪器功能扩展:

 

利用现有的钙离子系统,仅需针对图中所列荧光染料选配相应的滤光片组,就可以满足多种成像需求,达到系统功能扩展。

(责任编辑:泉水)
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