PCR引物合成介绍（Primer Design）(2)

答：引物是否好用，能否扩增出您需要的引物，与是否用软件设计没有太多的关系。引物设计有一定的指导意见，软件就是根据这些要求设计而成。不要迷信软件给您设计的引物，软件中一些参数您可能不明白，弄错了反而麻烦。其实，PCR扩增的成败最关键的是反应模板的制备和反应条件的控制。软件设计最大的毛病是，有时判断为该基因没有一段区域满足标准引物的要求。有时，我们需要扩增一段基因片段，引物的设计是没有太多的选择的。

26.为什么引物的OD260/OD280小于1.5 ？

答：我们多次接到类似的投诉：引物应该全是DNA,但是OD260/OD280的比值为什么那么低，怎么会有蛋白质污染？遇到这样的投诉有时我们感到很是为难。投诉者有时心情很不好，还不听解释。撇开其他不谈，引物化学合成，哪里有机会污染到蛋白质？

需要指出的是OD260/OD280的比值不能用来衡量引物的纯度。OD260/OD280的比值过低一般是由于引物中C/T 的含量比较高所致。下表是一个20mer 同聚体引物的OD260/OD280的比值，清楚表明OD260/OD280的比值与引物的碱基组成密切相关。

A260/280 ratios of Crude 20-mer Oligos of Differing Base Compositions

Base Composition A260/280

5-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3 2.50

5-GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG-3 1.85

5-CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC-3 1.15

5-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3 1.14

5-AAAAAGGGGGTTTTTCCCCC-3 1.66

27.同样的OD用PAGE检测，EB染色为什么深浅不一？

答：通常可以用EB染色的方法来判断双链DNA的量(如质粒DNA)，因为EB可以嵌合到双链DNA中。而合成的单链DNA，由于碱基组成不同，形成二级结构的可能性不同，EB的染色程度也会有差异，比如Oligo(dT)等不形成二级结构，EB染色效果就非常差。所以不要用EB染色的方法来定量，而用紫外分光光度计检测。同样道理，用EB染色来照片不适合所有引物。

28.引物不纯会有什么后果？

答：引物不纯可能会导致：1)非特异性扩增；2)无法用预先设计在引物5'端酶切位点的酶切开，特别是没有保护碱基的引物；3) 用于测序出现双峰或乱峰。解决办法重新合成或重新纯化。

29.为什么我们的引物重合了几遍都扩增不出来？

答：有些PCR扩增没有成功，怀疑是引物不好。要求我们重合，没有问题。可是有时遇到重合数次的引物PCR扩增还是不成功。这种情况的出现一般都是用户自己的原因。对于引物合成，我们只能做到合成的引物没有问题，至于您是否能够扩增出来您需要的产物，那得靠您自己对实验本身的理解和把握。我们不能杜绝我们不犯错误，但是引物合成犯同样错误的几率很小，想犯同样的错误都难。

PCR扩增不成功的因素很多，需要您耐心地分析，最好在实验时设置对照来判定原因。

如果您怀疑引物的问题，请您首先测定您溶解的引物的OD值，看实验时加入的引物量是否正确。如果量是正常的，请您告诉我司您的引物编号，我们会复查留存样品。如不明原因，我们免费为您重新合成一次。如果仍然不能扩增，请您查找其它原因。

30.已经溶解的引物，为什么原先使用正常，而过一段时间再使用就不好了？

答：如果您溶解引物的水PH过低或污染了菌或核酸酶，会使引物降解。使用时没有充分解冻混合，液体不均匀也可能会造成引物加入量不准确。建议分装引物，避免反复冻溶。建议使用10mM Tris pH7.5缓冲液溶解引物，因为因为有些蒸馏水的pH值比较低（pH4-5）, 引物在这种条件下不稳定。还有一种可能性是引物没有问题，而是PCR使用材料特别是模板的质量与先前使用的不完全一致。

31.引物质量好坏的判断标准是什么？

答：合成的引物和您的定单序列一致，而不是能否扩增出您所需要的产物。

32.引物是我们设计的，现在您扩不出来，我们要负责吗？

答：不负责任。我们免费为一些实验经验不足的人员，免费设计引物。引物设计好，我们都会发给您确认。设计引物时我们遵循一般的指导原则，但是设计的引物是否能够满足您的实验要求，扩增出您需要的基因片段，我们就不能保证了。我们遇到一些用户，他们讲：引物是你们设计的，也是你们合成的，我做不出，你们就要付责任。听到这样的抱怨，觉得心寒。

33.PCR扩增不出就引物有问题吗？

答：基本不是。当今发展出各色各样的PCR扩增技术，各色各样的高温聚合酶，就是来解决PCR扩增中遇到的扩不出，扩增效率低的问题。如槽式PCR就是扩增那些拷贝数很低的基因片段。有些重复片段的扩增, GC含量高的片段，非要采用特殊扩增手段才能扩增出了。

引物扩增不出，主要是下列两种情况比较常见（1） RT-PCR。请注意，很多基因通过常规RT –PCR方法是很难不增出来的。 RT- PCR成功的关键在于RT的反应的RNA质量和目标基因在特定组织和细胞中含量。（2）从基因组中扩增。一般情况下，基因在基因组中都是单拷贝，基因组作为模板需要严格控制用量。基因组DNA过高，会影响反应体系中的Mg和pH。

34.PCR扩增有很强的非特异条带，说明引物有污染吗？

答：不能。瞧，扩增目标很弱或没有，道是非特异性条带很亮，说明引物不纯或有污染。一些用户如是说。我们曾分析过一些非特异条带，测序发现在这些非特异性片段的两头至少可以发现一条引物序列。我们只能说非特异性扩增一般是模板污染（如RNA中污染基因组）或扩增条件不合适所致。

35.引物合成的价格合理吗，还有下浮的空间吗？

答：不合理。对引物合成的成本，我们做了准确的统计和评估，认为现阶段引物的价格处于一种非理性化状态，价格已基本探底。引物合成的成本主要由四部分组成：（1）合成原料（2）设备折旧（3）人员费用（4）场地和水电等消耗。其中合成原料占生产成本占30%，设备折旧占30%，人员费用占20%，场地和水电消耗等20%。我们的合成成本控制是相当到位，原料管理也非常严格，原料进货成本不可能高于同行。现行的引物合成价格，已让我们感到十分吃力。我们需要对我们的用户负责，我们需要体现做人的准则，我们需要交税，我们需要收回设备的采购费用，我们需要给我们的用户提供配套服务，这些需要才使我们还在做引物合成。引物合成业务的利润空间可能还赶不上菜场上买鱼的。

上海申能博彩生物科技有限公司 (责任编辑：泉水)

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