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RACE PCR技术

时间:2008-11-05 14:52来源:IVITROGEN 作者:bioguider 阅读:

经典的RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) 技术是由Frohman等发明的一项技术,主要通过RT-PCR技术由已知部分cDNA序列来得到完整的cDNA5′和3′端,包括单边PCR和锚定PCR。

 

该技术提出以来经过不断发展和完善,克服了早期技术步骤多、时间长、特异性差的缺点。对传统RACE技术的改进主要是引物设计及RT-PCR技术的改进:

改进之一是利用锁定引物((lock docking primer)合成第一链cDNA,即在oligo(dT)引物的3′端引入两个简并的核苷酸【5′-Oligo(dT)16-30MN-3′ ,M=A/G/C;N=A/G/C/T】,使引物定位在poly(A)尾的起始点,从而消除了在合成第一条cDNA链时oligo(dT)与 poly(A)尾的任何部位的结合所带来的影响;

改进之二是在5′端加尾时,采用poly(C),而不是poly(A);

改进之三是采用RNase H-莫洛尼氏鼠白血病毒(MMLV)反转录酶或选择嗜热DNA聚合酶可能在高温(60度-70度)有效地逆转录mRNA,从而消除了5′端由于高CC含量导致的mRNA 二级结构对逆转录的影响;

改进之四是采用热启动PCR (hot start PCR)技术和降落PCR(touch down PCR)提高PCR反应的特异性。

      随着RACE技术日益完善,目前己有商业化RACE技术产品推出,如CLONTECH的MarathoTM技术和SMART RACE技术术。邢桂春等先后使用上述两种试剂盒进行RACE反应,结果发现使用Marathon所得到的片断总是比采用SMART RACE试剂盒到所得到的片断短。其原因在于Marathon技术反转录反应往往不能真正达到mRNA的5′末端。所以认为,进行RACE反应应当优选 SMART RACE试剂盒。

      SMART 3′-RACE的原理是:利用mRNA的3′末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点,以连有SMART寡核营酸序列通用接头引物的 Oligo(dT)30MN作为锁定引物反转录合成标准第一链cDNA。然后用一个基因特异引物GSP1(gene specific primer,GSP)作为上游引物,用一个含有部分接头序列的通用引物UPM(universal primer,UPM)作为下游引物,以cDNA第一链为模板,进行PCR循环,把目的基因3′末端的DNA片段扩增出来。

5′ - Full RACE的扩增原理图

3′ - Full RACE的扩增原理图

(责任编辑:泉水)
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