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荧光探针和荧光染料

时间:2005-11-26 19:46来源:本站原创 作者:bioguider 阅读:

实时荧光PCR定量包括探针类和非探针类两种,探针类是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加,非探针类则是不利用杂交原理,而利用其他的一些理化特征指示扩增产物的增加。前者由于增加了探针的识别步骤,特异性更高,但后者则简便易行。

1TaqMan 探针

TaqMan 探针是一种寡核苷酸探针,荧光基团连接在探针的5’末端, 而淬灭剂则在3’末端。当探针与靶序列配对时,荧光基团发射的荧光因与3’端的淬灭剂接近而被淬灭。在进行延伸反应时,聚合酶的5’外切酶活性将探针切断, 使得荧光基团与淬灭剂分离,发射荧光。一分子的产物生成就伴随着一分子的荧光信号的产生。随着扩增循环数的增加,释放出来的荧光基团不断积累。因此Taqman探针检测的是积累荧光。常用的荧光基团是FAMTETVICHEX

2.分子信标(molecular beacon

分子信标是一种呈发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针,两端的核酸序列互补配对,因此标记在一端的荧光基团与标记在另一端的淬灭基团紧紧靠近。荧光基团被激发后产生的光子被淬灭剂淬灭,由荧光基团产生的能量以红外而不是可见光形式释放出来。

分子信标的茎环结构中,环一般为15-30 个核苷酸长,并与目标序列互补;茎一般5-7 个核苷酸长,并相互配对形成茎的结构。荧光基团标记在探针的一端,而淬灭剂则标记在另一端。在复性温度下,因为模板不存在时形成茎环结构,当加热变性会互补配对的茎环双链解开,如果有模板存在环序列将与模板配对。与模板配对后,分子信标将成链状而非发夹状,使得荧光基团与淬灭剂分开。当荧光基团被激发时,因淬灭作用被解除,发出激发光子。由于是酶切作用的存在,分子信标也是积累荧光。常用的荧光基团:FAM Texas Red


3SYBR Green I

SYBR Green I 是一种能与双链DNA 结合发光的荧光染料。其与双链DNA结合后, 荧光大大增强。因此, SYBR Green I的荧光信号强度与双链DNA的数量相关,可以根据荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量。SYBR Green I 的最大吸收波长约为497nm,发射波长最大约为520nm

SYBR Green I 的缺点:由于SYBR Green I没有特异性,不能识别特定的双链,只要是双链就会结合发光,对PCR反应中的非特异性扩增或引物二聚体也会产生荧光。所以在临床上使用可能会有假阳性发生。

SYBR Green I优点:SYBR Green I的优点是因为其缺点产生,由于它能所有的双链DNA相结合,所以对不同模板不需特别定制,通用性好,并且价格相对较低。这对科研是很有利的,因此国内外在科研中使用比较普遍。

4. 荧光谐振能量传递(FRET

  FRET探针是罗氏的发明专利,又称双杂交探针,FRET探针由两条相邻探针组成,在一条探针的5`端标记FAM荧光基团,另一探针的3`端标记Red 640荧光基团。当复性时,探针结合在模板上,FAM基团和Red640基团相邻,激发FAM产生的荧光,作为Red640基团的激发光被吸收,使Red640发出波长为640的荧光。当变性时,探针游离,两基团距离远,不能产生640波长的荧光。由于FRET探针是靠近发光,所以检测信号是实时信号,非累积信号。常用的荧光基团是:LC-Red640LC-Red705

5LUX Primers

LUX (light upon extention) 引物是利用荧光标记的引物实现定量的一项新技术。目的使用类分子信标的发夹结构设计引物,使引物同时起到荧光探针的作。引物对中的一个引物3’端用荧光报告基团标记。在没有单链模板的情况下,该引物自身配对,形成发夹结构,使荧光淬灭。在模板存在的情况下,引物与模板配对,发夹结构打开,产生荧光信号。使用LUX引物,不需要专门设计探针,即省了成本又给实验设计提供了宽松的条件。由于没有探针控制特异性,因此他的特异性要弱于探针技术,但非特异性扩增或引物二聚体没有影响,所以其特异性要强于SYBR GREEN

.LUX 引物工作原理

能用于实时荧光PCR定量的方法很多,各有特点。

SYBR GREEN

FRET探针

Taqman

分子信标

LUX 引物

性质

可逆荧光

积累荧光

熔点分析

不能

特异性

引物(非特异性扩增或引物二聚体有影响)

引物+2探针

引物+探针

引物+探针

引物(非特异性扩增或引物二聚体无影响)

探针

不需要

需要

需要

需要

不需要

通用性

通用

专用

专用

专用

专用


(责任编辑:泉水)
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