四、 问答题。1——4题选做3题，每题6分； 4题必做，7分。共25分。
题　　目：1、简述在真核基因表达调控中，结合在不同部位的调控蛋白质之间相互作用的可能方式。
考查点 ：　真核基因表达的各层次的调控。
答　　案：　真核基因表达的调控分为无个层次：转录前水平、转录水平、转录后水平、翻译水平、翻译后水平。在这当中，调控蛋白的作用有：
转录前水平　　调控基因的丢失，基因扩增，基因重排，HMG蛋白与DNase优先敏感位点，DNA甲基化水平的调整，组蛋白修饰。
转录水平　　转录过程中，调控蛋白通过反式作用因子、顺式作用元件的相互作用来调节转录的起始、转录的速率及转录的终止。
转录后水平　　 调控了对hnRNA的加工，通过改变mRNA的种类、大小、数量等调节了基因的表达。
翻译水平　　通过调节氨基酸数量，多核糖体的形成，信号肽的切除，其实密码子，中指密码子等调节了基因的表达。
翻译后水平　　 通过调节修饰蛋白，调节蛋白构象及其定位等调节了基因的表达。
其中，转录水平的调控有如下机制：
①顺式作用元件与反式作用因子的相互作用。　基因的所有顺式调控成分，包括上游启动子成分（UPF）和增强子，都要与相应的反式作用因子结合，结合后通过蛋白质之间的相互作用（包括反式作用因子之间的作用，反式作用因子与顺式作用元件的相互作用），才能实现它们对基因转录的调控。
②可诱导的顺式调控成分。　它主要是指那些热震惊、重金属、病毒感染、生长因子、固醇类激素等作出反应的基因调控成分。这些成分中有增强子和部分UPF成分。
不同物种的同一诱导基因的顺式调控成分有很大的保守性。
顺式调控成分对基因转录的激活作用可以通过不同途径。可能是一种正调控因子的激活，也可以是阻遏蛋白的失活，也可以是它们同时发生。
③一些组织特异性的顺式调控成分也参与调控。
题　　目：2、简单说明有那些方法可以得到所需要的基因。
考查点 ：　目的基因的获取方法。
答　　案：　概括地讲，有如下方法可以获得目的基因：
　　⑴PCR法　 设计特定的引物，即可以扩增得到特定目的基因。
⑵酶法　　经过特定的限制性内切酶作用及凝胶电泳后可以专一的获取特定大小的目的基因。
⑶探针法　 用特定的探针（探针根据DNA序列、RNA序列或蛋白质序列进行设计）从总DNA溶液中获取特定目的基因。
⑷cDNA法　 用特异功能的mRNA进行反转录，也可以获取特定目的基因。
⑸用差别杂交或扣除杂交法获取特定目的基因。
⑹用mRNA差别显示技术分离目的基因。
⑺用表达文库分离目的基因。
⑻双酵母杂交体系获取目的基因。
如下方法，见姚连生、郑仲承《核酸与生命》一书（科学出版社，1985-10，85——89）
①密度梯度离心法　 适用于有特别密度的目的基因，如1.723g/cm3梯度层分离rDNA。
②两相分配法　　目的基因有特殊的碱基组成，而在有机溶剂中相、水相中分配比例不同。
③逆相层析法　　用聚氯三氟乙烯粒子作为支持体，将DNA上拄吸附，用梯度盐溶液洗脱：可将珠蛋白基因纯化500倍。
④多聚赖氨酸法　 选择性地沉淀GC含量少的DNA，再用四甲胺处理上清，可沉淀GC含量多的DNA。
⑤凝胶电泳法　　依据目的基因的大小，在酶解DNA片段电泳后，从相应胶区回收其DNA即为目的基因。
⑥反转录法　　 纯化目的蛋白质的mRNA，用反转录法得到其互补DNA。
⑦人工合成基因　　知道蛋白质的氨基酸顺序，就可以根据密码子推断其基因组成并人工合成起DNA序列。
相关内容：　各种目的基因获取的方法步骤及原理。
题　　目：3、简述转座元和共合体的异同。
考查点 ：　基因的转座成分。
答　　案：　基因组中的可转移成分叫转座单元，简称转座元（transposons）。转座涉及到转座元的复制。当一个拷贝插入到基因组的新位点后，原来的位点上仍然保留有一个拷贝。转座作用不依赖于转座元和靶点间任何的序列同源性。其转座插入还表现出极性效应：转座元在操纵元上游基因的插入影响到下游基因的表达。其原因是转座元中有终止信号，其插入造成mRNA转录的终止，其无义密码子也使翻译终止。转座的作用有：①造成直接或间接的基因重排。直接的效应有：复制元融合，基因缺失、倒位、易位；间接的效应有是插入不同染色体或同一染色体不同位置上的同一转座元可以做为袖针同源区域而允许重组发生，从而导致缺失、插入、基因扩增、倒位、易位；②可能是某些细菌质粒的进化方式；③细胞基因组或噬菌体基因组能捕获一些转座元，使之变成基因组的一个组分，负责具有某种调节功能的特异性转座作用。
　　当含有一个转座元的复制元和另一个复制元处在同一个细胞中时，它们可以融合在一起形成共合体（cointegrate），也叫复制元融合。参与融合的复制元可以是质粒、噬菌体或细菌染色体。所形成的共合体同时含有两个转座元，他们分别处在两个复制元的交界处，具有形同虚设的方向。有复合转座元所导致产生的共合体中新的转座元拷贝可能是整个的复合转座元，也可以是其中的一个IS组件（形成IS共合体）。所有的转座元都可以导致共合体的产生，但产生频率、稳定性不同。有共合体的细胞，多个世代后共合体消失，其构成质粒又单独存在。每个质粒均有一个转座元拷贝。原来单独存在有一个转座元的质粒，多个世代后也有形成共合体，也会质量粒单独存在，但均有一个转座元拷贝。
题　　目：4、什么叫染色体步行法？利用什么原理进行的？简述之。
考查点 ：　基因定位的方法及步骤。
答　　案：　真核生物的基因较大，在制作基因组文库（一个克隆内的每个细胞内的载体上都包含有特定的基因组DNA片段，这样的一套克隆叫基因组克隆，其中克隆的一套基因组片段即为基因组文库。）时也常被打断，使之分散在两个或两个以上的克隆中。除了可以不同的探针寻找外，也可以通过已经找到的克隆，取其外源DNA的末端片段进行亚克隆，然后分离这段DNA，经放射性标记，作为探针再与基因组文库中其他克隆进行杂交，以寻找与原来克隆中外缘DNA片段有重叠的基因组克隆。利用这种方法不但可以重建一个大的基因，而且可以鉴定染色体上很大的区域。即可以从染色体上某一已知的起始点，可以“步行”到染色体上另一个区域并考察所经过的路程，如限制酶图谱甚至序列分析，因而这种方法称染色体步行法。
题　　目：5、简述E.ColiDNA复制起始的主要步骤。
考查点 ：　复制的起始。
答　　案：　大肠杆菌DNA复制起始的步骤如下：
　　⑴转录激活　　　　由RNA聚合酶发动的转录作用主要从16Kda基因的启动子（Pz）以及asnC的启动子（P1）开始，由右至左进入oriC。这些转录物在oriC内大约有20个终止点簇。其中大部分位于oriC的左半边。
⑵起始复合物的形成　　需要负超螺旋的oriC、ATP、DnaA、HU蛋白、TopI。DnaA结合于R1—R4位点；HU蛋白识别并刺激oriC复制而抑制其它潜在的复制原点上的复制；TopI也是oriC特异性复制所必需。ATP是必需的但不被水解。
⑶预引发体的形成　　 其前提条件是DnaA已经结合于R1—R4位点。DnaB-DnaC六聚体与oriC结合预引发体。
⑷RFI*的形成　　 在DnaB的螺旋酶活性和DNA旋转酶的拓扑异构酶活性作用下，以水解ATP为能源，促进大范围的解链（SSB与单链DNA结合），在oriC区域负超螺旋提高10-15倍，形成一个具有很高迁移率的复制形式，称RFI*。
⑸引发体的形成　　 高度解链的模板与蛋白质的复合体促进DNA引发酶加入进来形成引发体，然后合成引物RNA。
⑹DNA的合成　　　由DNA聚合酶Ⅲ全酶担任，其中α-亚基为聚合酶，ε-亚基为3’→5’外切核酸酶，β-亚基保证全酶作用的进行性，τ-亚基和γ-亚基复合体则保证了β-亚基作用的发挥。