武汉大学生科院张楚富教授等原作！非常感谢！

第二章　　 氨基酸和蛋白质的一级结构
基本内容
蛋白质含有20种标准氨基酸，这些氨基酸在它们的α碳原子上分别含有一个氨基、一个羧基和一个侧链基团（或称R基团）。除甘氨酸外，所有其它氨基酸的α碳原子都是一个不对称的碳原子，即手性碳原子。蛋白质中的所有氨基酸都是L-型的。
20种标准氨基酸可以根据它们侧链的结构分为含脂肪烃基的氨基酸、含芳香基的氨基酸、含硫的（或含羟基的、或含酰胺基的）氨基酸。如果根据它们的侧链极性（或在生理pH下的解离），可分为侧链非极性氨基酸、侧链不带电荷的极性氨基酸和侧链解离带正电荷或负电荷的氨基酸。氨基酸侧链的性质对于决定蛋白质的性质、结构和功能来说是很重要的。
氨基酸的α-氨基和α-羧基都是可解离的基团，它们的解离取决于介质的pH。在生理pH下，α-氨基解离带正电荷（–NH3+），α-羧基解离带负电荷（–COO–）；侧链可解离基团的解离取决于它们的pK值和介质的pH。氨基酸的解离性质是建立分离和分析氨基酸的方法的基础，它们的解离也影响蛋白质的性质、结构和功能。分离分析氨基酸的主要方法是离子交换法以及电泳法。
蛋白质是由氨基酸借肽键连接而成多聚物。在蛋白质多肽链中，肽键是唯一的共价键，由一个氨基酸的α-羧基和相邻氨基酸的α-氨基脱水缩合而成。在多肽链中，氨基酸残基的顺序称为蛋白质的一级结构。
蛋白质是生物大分子，虽然它们具有与氨基酸相似的解离性质，但这一性质却比氨基酸复杂。蛋白质的许多重要的性质，例如，溶解性、极性、带电性质、分子大小以及配体亲和性等，是构成分离分析它们的方法的基础。离子交换法、凝胶过滤法、亲和层析法、超速离心法以及各种电泳法是常用的方法。
蛋白质一级结构的测定通常采用这样的程序，即纯净样品的末端分析、氨基酸组成分析、专一性酶或化学试剂进行部分水解、Edman降解法测定肽碎片的氨基酸残基的顺序以及片段重叠。末端分析常有丹磺酰氯法和二硝基氟苯法；肽链的部分水解一般是有胰蛋白酶法、胰凝乳蛋白酶法以及溴化氰法。
氨基酸顺序的分析能揭示不同来源的蛋白质彼此之间的进化关系，亦为分子病的诊断提供可靠的依据。
第二章　　 氨基酸和蛋白质的一级结构
习题
2–1．图2—1的滴定曲线描述了谷氨酸的电离。请回答下列问题：①指出三个pK’a的位置；②指出Glu－和Giu＝各一半时的pH；③指出谷氨酸总是带净正电荷的pH范围；④指出Glu±和Glu－能作为一种缓冲液的共轭酸碱对的pH范围.

　　　　　　　　图2-1 谷氨酸的酸-碱滴定曲线

2–2．为什么甘氨酸处在等电点时是以偶极离子的形式存在，而不是以完全不带电荷的形式存在？处在等电点时，其完全不带电荷的形式是多少?
2–3．甘氨酸是乙酸甲基上的氢被氨基取代生成的，但是，甘氨酸羧基的pK’a值比乙酸羧基 pK’a低。为什么?
2–4．在pH9.0时，计算赖氨酸的两性离子、阳离子以及阴离子所占的比例。已知赖氨酸三个可电离基团α-COOH，α–NH3+和ε- NH3+的pK’a值分别为2.18、8.95和10.53。
2–5．用强酸型阳离子交换树脂分离下述每对氨基酸，当用pH7.0的缓冲液洗脱时，下述每对中先从柱上洗脱下来的是哪种氨基酸?
①天冬氨酸和赖氨酸；②精氨酸和甲硫氨酸；⑧谷氨酸和缬氨酸;④甘氨酸和亮氨酸；⑤丝氨酸和丙氨酸。
2–6．计算出由Ala、Gly、His、Lys和Val所构成的可能的五肽数目。
2–7．在大多数氨基酸中，α–COOH的pK’a值都接近2.0，α–NH3＋的pK’a值都接近9.0。但是，在肽中，α–COOH的pK’a值为3.8，而α–NH3＋的pK’a比值为7.8。你能解释这种差别吗?
2–8．某蛋白质用凝胶过滤法测定的表观分子量是90kD；用SDS-PAGE测定时，它的表观分子量是60kD，无论2-巯基乙醇是否存在。哪种测定方法更准确？为什么？
2–9．一种分子量为24,000、pI为5.5的酶被一种分子量类似、但pI为7.0的蛋白质和另外一种分子量为100,000、pI为5.4的蛋白质污染。提出一种纯化该酶的方案。
2–10．下面的数据是从一个八肽降解和分析得到的，其组成是：Ala、Gly2、Lys、Met、Ser，Thr、Tyr。该八肽
用CNBr处理，得到：①Ala、Gly、Lys、Thr； ②Gly、Met、Ser、Tyr
用胰蛋白酶处理，得到：①Ala、Gly； ②Gly、Lys、Met、Ser、Thr、Tyr
用糜蛋白酶处理，得到：①Gly、Tyr； ②Ala、Gly、Lys、Met、Ser、Thr
经分析，N–末端残基是：Gly
C–末端残基是：Gly
请确定该肽的氨基酸顺序。

第二章 氨基酸和蛋白质的一级结构
解答：
2–1解答: ①三个pK’a的位置如图2—4所示

图2–4 谷氨酸的酸-碱滴定曲线显示出它的三个
pK’a的位置以及它在不同pH下的电离状态
②Glu－和Glu＝各一半的pH值为9．67。
③当pH小于3.22时，谷氨酸总是带净正电荷。
④Glu±和Glu－作为一种缓冲液的共轭酸碱对的pH范围是pH4.25左右
2–2解答：因为羧基的酸性(pK’a=2.36)比质子化的氨基的酸性强得多(pK’a=9.60)。因此，羧基将倾向于供出质子使氨基质子化，并且其平衡常数是107。这表明平衡状态非常强烈地偏向右边：

因甘氨酸的等电点是5.97，首先我们需要测定甘氨酸处在等电点时〔–COO－〕/〔–COOH〕和〔H3+N–〕/〔–NH2〕的比例。如果我们单独处理每个功能基团，并利用Henderson—Hass- elbalch方程，就会得到：

两者合并起来考虑时，两性离子与完全不带电荷的比例是：

因此，甘氨酸处在等电点时，大约1／107以不带电荷的形式存在的。
2–3解答：甘氨酸羧基的pK’a值为2.34，乙酸羧基的pK’a值是4.7。当甘氨酸溶液的pH值低于6.0时，氨基以正电荷的形式存在。这种正电荷通过静电相互作用使带负电荷的羧基离子稳定。这就意味着甘氨酸的羧基将比较容易失去它的质子，因而它是一种更强的酸(具有更低的 pK’a值)。
2–4解答：赖氨酸有三个可电离的质子：

[Lys±]＝1.12[Lys＋]＝1.12×46.45＝52

由此可见，在pH9.0时，〔Lys＋＋〕含量甚微，可以忽略不计，〔Lys＋〕占46.45％，〔Lys＋－〕为52％，〔Lys－〕为1.53％，整个分子带部分正电荷。

2–5解答：氨基酸从离子交换柱上被洗脱下来的速度主要受两种因素的影响：①带负电荷的树脂磺酸基和氨基酸带正电荷的功能基团之间的离子吸附，吸附力大的在树脂上停滞的时间长，从柱上洗脱下来的速度慢；②氨基酸的侧链基团与树脂强非极性的骨架之间的疏水相互作用。非极性大的侧链R基氨基酸与树脂骨架间的疏水作用力强，从树脂柱上洗脱下来的速度慢。
　根据氨基酸可电离基团的pK’a值，我们可以确定题中每组氨基酸的结构以及在pH7时它们的平均净电荷。如果平均净电荷相同，则取决于它们侧链基团的疏水性。
　①天冬氨酸净电荷为–l，赖氨酸净电荷为+1；赖氨酸与树脂磺酸基相反离子吸附力大。因此，天冬氨酸先被洗脱下来。
　②精氨酸净电荷为+1，甲硫氨酸净电荷接近零。因此，甲硫氨酸先被洗脱下来。
　③谷氨酸净电荷为–1，缬氨酸净电荷接近零，谷氨酸的负电荷与树脂荷负电的磺酸基之间相互排斥，减小了谷氨酸与树脂的附着力，故先被洗脱下来。
　④甘氨酸和亮氨酸的净电荷都接近零，但亮氨酸庞大的非极性侧链与树脂骨架之间的非极性相互作用力大。故甘氨酸先被洗脱下来。
　⑤丝氨酸和丙氨酸的净电荷都接近零，但丝氨酸的侧链非极性小，故先被洗脱下来。
2–6解答：五肽的第一个残基是五个残基中的一个，第二个残基是余下四个残基中的一个，余此类推。因此，可能形成的五肽数目是：5×4×3×2×1＝120