第一章 中心法则导论 科学预见→分子生物学诞生 一、中心法则的提出和修正 遗传物质:⑴能独立的自我复制,⑵对细胞的特异性有高度影响。 1958 年 Crick 提出: 要点:⑴遗传信息; ⑵信息的流动是单程 的;⑶序列假说。 1970 Temin:Nature 《Central Dogma Reverse 》 二、挑战 ㈠蛋白质的遗传信息不一定来自核酸 ⑴以蛋白质为模板的肽链合成 ⑵遗传信息的翻译后加工 ① 切割,糖基化;②两段C 端均切去一段小肽;③原来的N 端和C 端连接。 非DNA 信息的加工过程 ⑶朊病毒(Prion) Kuru. CJD Scrapie mad cow disease 引起动物神经系统软化,共济失调 蛋白质性质 PrP 两种形式: PrPc 正常 PrPsc 异常 被蛋白酶降解抗蛋白酶 可溶不溶 α螺旋40% α螺旋 20% ,β螺旋50% 相互关系:PrPc ↓→PrPsc↑(转化) 种间障碍: 正常内源性PrPc 是病毒作用的靶位点,体外PrPsc 不能将PrPc 完全转化为PrPsc 同一宿主能被多种菌株感染 ㈡RNA 的信息不完全来自DNA―― 模糊基因 Eg:锥虫的cox Ⅲ中167 个位点上398 个U 插入,9 个删除. 探针.60%RNA 编辑.gRNA. 三、中心法则在生命系统中的地位 细胞模板:细胞膜 DNA 参与一切,但不是决定一切 Eg:朊病毒:成核依赖的蛋白质多聚化模型 开放式中心法则:如下页图所示。
第二章 遗传的物质基础 第一节 什么是遗传物质 一、DNA 是遗传信息的携带者 转化实验:捣碎实验: 基因:编码一条有功能的多肽链或RNA 所需的DNA 序列 DNA 作为遗传信息的原因:⑴信息量大,分子量大; ⑵双螺旋结构,能自我复制;⑶2’脱氧,稳定性好; ⑷易突变;⑸有T,无U。(如右图所示) 第二节 DNA结构 一、. DNA 的一级结构 定义:核苷酸排列顺序,或称碱基排列顺序。
5’-ATCGGCTAAGGCTCCGACGA--3’ 3’-TAGCCGATTCCGA GGCTGCT--5’ 人类基因组计划――20 世纪生物学最宏伟计划:人类基因组的作图与测序。 人类基因组计划(1990-2005);计划耗资30 亿美元。人类基因组有30 亿碱基对的测序。 二、DNA 的二级结构 DNA 的二级结构就是双螺旋结构。 受环境因素, 如平衡离子类型、离子强度、特异结合蛋白、水合状态等的影响, 以及DNA 分子碱基的组成都可促使DNA 分子取不同的构象。 DNA 分子存在多种构象――二级结构的动态结构 ㈠B 型结构(右手双螺旋) B-型结构也称右手双螺旋结构。1953 年由Watson 和Crick 首先提出。 这是水溶液(或相对湿度92%以上)中的主要构象。 提出双螺旋构象的根据: B-型DNA 构象的主要内容:⑴右手双螺旋;⑵两条链反平行;⑶磷酸,核糖在外侧,碱基在 内侧;⑷一周螺旋,10 个碱基,螺距3.4nm; ⑸遵守AT,CG 配对规律;⑹双螺旋分子存在大沟, 小沟。 ㈡A 型结构 相对湿度<75%,矮胖型,直 径大。 ㈢Z 型结构 Wang 等人在研究人工合成 的d(CGCGCG)单晶的X-射 线衍射 图谱发现主链呈锯齿排列。 Z 型结构实验依据: Z-型构象的主要特征:⑴糖 -磷酸主链的走向呈之字形, 分子呈左手螺旋构象每一 螺圈含12 对碱基, 距离为 4.46nm 。⑵糖环折叠不同于A 或B 型DNA, 鸟嘌呤碱基绕糖苷键旋转呈顺式构型,而嘧啶碱 基仍是反式构型, 前者的糖环折叠是C3-endo,后者是C2-endo 。 Z-DNA 仅有一条小沟, 且 较深, 含有较高的负电荷密 度。 Z-DNA 较B-DNA 细而“舒 展”, 螺旋直径为1.8nm 。 翻板假说: 影响因素: DNA 构象家族:
三种构象特征的比较: ㈣沟信息的识别 大沟和小沟的信息区别:氢键O,N,受体a, NH2 供体d 大沟(a-d-a) A-T 小沟(a-a) 小沟( a-a-d,d-a-a) G-C 小沟(a-d-a) ㈤DNA 二级结构的其他构象 ⑴十字型――反向重复序列 生物学功能: ⑵DNA 的四链结构 特征:①鸟嘌呤四联体;②G-G 首 尾相接,异常氢键;③片层堆积, 所有的方向一致。 生物体中可能存在G 四联体的依 据:
⑶三螺旋DNA 存在条件:一条全嘌呤,另一条全嘧啶。 特征:①两条全嘧啶链和一条全嘌呤链组成三螺旋结构;②氢键为Hoogsten 氢键;③第三 条链位于正常双螺旋的大沟中。 三、DNA 的三级结构—超螺旋结构 形成条件: 类型: 性质的变化: 生物学意义: 拓扑性质: 通常以链环数(Linking number) 表示 超螺旋的的拓扑性质。 是指一个环状封闭双螺旋DNA 分子 两条链彼此交叉的次数。 L = W+T(T:代表双螺旋中的罗圈数, 数量=总碱基数/每一罗圈的碱基数。 W:超螺旋的程度,双螺旋中心轴盘 绕的圈数。松弛分子的W 值等于零。) 举例:一个200bp 的环状闭合双链 DNA 松弛型,没有超螺旋 W=0 L= W+T = 0+ 200bp/10 bp=20 负超螺旋,形成1 个超螺旋 W=-1 L=W+T = -1+ 200bp/10 bp=19 正超螺旋,形成1 个超螺旋 W=+1 L=W+T = 1+ 200bp/10 bp=21 具有完全相同顺序,而L 值不同的 DNA 称拓扑异构体(Topological isomers) 。
拓扑异构体的互变由拓扑异构酶催化。发生一条链或两条链的断开和连接。 拓扑异构体:具有完全相同的碱基顺序,但L 值不同的超螺旋。分为I, II 型 两种拓扑异构酶:Topoisomerase I , II 第三节 DNA双螺旋的呼吸作用 甲醛的变性实验 呼吸作用的定义 碱基对的稳定性 生物学作用 第四节 DNA的变性复性和分子杂交 一、变性(溶解) 在某些物理化学因子的作用下,DNA 双链间的氢键断裂,双链解离形成单链。 ㈠性质变化 增色效应;黏度降低;沉 降速度增加。 ㈡因素 ⑴温度:温度升高引起的 DNA 变性称热变性。加热 使氢键断裂。 可用热变性曲线描述热变 性过程。见下图 融点Tm:50%DNA 分子解链时的温度。 融点与DNA 分子中的GC 有关,随(G+C)% 的含量呈线性增加 ⑵化学:甲酰胺破坏氢键 二、复性 去除变性条件后,单链DNA 在适当条件下重新形成双链,回复到原有的物理和生物学特性。
㈠复性动力学 复性过程是两条单链DNA 碰撞形成双链DNA 的过程,是双分子反应。服从二级反应动力 学规律。 控制复性反应的两个参数是C0 和t Rate of reaction The reaction follows the second order equation C is the concerntration of DNA that is single-stranded at time t k is a reassociation rate constant. Progress of reaction Integrate the rate equation between the limits; Initial concerntration of DNA=C0 at time t=0; Concentration remaining single stranded=C after time t Critical parameter is C0t1/2 When the reaction is half complete at the time t=1/2 Therefore C0t1/2=1/k. 复性反应进行到50% 时的C0 .t 为C0 t1/2 C0t 曲线:用已经复性的DNA 浓度,即1-C/C0 对C0t 的对数作图。如右图所示. C0t 值的意义:C0 t1/2 值可以用来表示反应体系 中DNA 的总长度(单拷贝)。这种总长度称为 DNA 的复杂性。通过测定复性动力学可以预测 基因组的大小。 真核基因组DNA 的复性动力学: 第1 是快复性动力学组分,高度重复序列。 第2 是中复性动力学组分,中度重复序列。 第3 是慢复性动力学组分,单拷贝序列。 X:DNA 的复杂性 C0t 曲线特征:⑴原核生物每种图形的现状 大致相同;⑵重复序列多,复性快。 曲线意义:求DNA 的复杂度。 三、分子杂交
原理:基于DNA 的变性与复性的特性。双链DNA 加热以后,变成单链,在去除变性条件 后,在一定的条件下,具有互补顺序的DNA 能再形成双链。 探针:一种标记的一段DNA 或RNA,与待 测基因序列的DNA 或RNA 互补 分子杂交技术的种类:⑴固相杂交(待测核 酸固相化);⑵Southern blot ,待测核酸为DNA;⑶Northern blot ,待测核酸为RNA。 液相原位杂交示意图:⑴Dots hybridization,点状杂交,待测核酸为DNA 或RNA;⑵Colony or plaque hybridization, 菌落或噬菌班杂交,待测核酸为DNA。⑶Tissue hybridization ,组织 原位杂交,检测mRNA 表达和定位。 研究基因的定位,拷贝数,测序。 菌落原位杂交: 基因文库:染色体DNA 文库,cDNA 文库。
第三章基因和基因组 一、原核生物基因组 ⒈特征 ⑵通常含有质粒; ⑶操纵子结构; ⑷顺反子; ⑴只有一个染色体; ⑸有SD 序列; ⑹基因重叠; ⑺一般没有内含子; ⑻只有一个复制起始位点; ⑼以RNA 为产物的基因往 往是多拷贝的,蛋白质基因 单拷贝。⒉⑴фX174 ;⑵λ噬菌体 1.染色体、核小体结构 二、真核生物基因组 ⑴染色体功能实现三要素:①着丝点;②端粒;③复制起始点。 ⑵基因组大小和C 值矛盾 C 值:单倍体基因的全部DNA 含量。 C 值矛盾:①与预期相比,C 值明显过大;②同一物种,C 值相差很大。 ⑶基因组的基因数目(下表:不同生物的基因数目)。 种类基因组大小(bp) 基因数目 支原体 1.0×106 750 噬菌体T4 1.6×105 200 大肠杆菌 4.2×106 2350 酵母 1.3×107 6100 果蝇 1.4×108 8750 人 3.3×109 65000-80000 ⑷真核生物基因组序列特征: 具有多个复制起始位点;编码序列仅占一小部 分(3%) ,大部分为非编码序列。 单拷贝序列;轻度重复序列; 中度重复序列;高度重复序列。 不同物种中,重复序列/非重复序列的比例相差很大,原核基本不重复。 ⑸真核生物的重复序列 ①基因家族:Ⅰ.珠蛋白;Ⅱ.rDNA;Ⅲ.tDNA;Ⅳ.组蛋白基因。 rRNA 基因:酵母:140 次;果蝇:130~250 次;人类:300 次。 10
组蛋白基因家族: 左图1 为组蛋白 基因家族,箭头 ←→表示转录 方向,右侧数字 表示基因组重 复次数。 左图2 为真核生 物基因组中不同 的多基因家族。 ②Alu 的重复序列:Ⅰ.AG↓CT;Ⅱ.散布;Ⅲ.Alu 序列;Ⅳ.约90% 相同。 ③卫星DNA Ⅰ.隐蔽卫星DNA Ⅱ.小卫星DNA Ⅲ.微卫星DNA A.单拷贝序列特征 a.含有内含子 内含子(intron) 外显子(exon) 内含子检测: 限制性内切酶图谱 DNA 的杂交内含子GT/AG 规则: 内含子与外显子连接处的序列特异: 内含子5’端为GT,3 ’端为AG, GT/AG 规则. --------GT--------AG-------- 外显子内含子外显子 B.存在不同的转录单位 a.简单转录单位 转录单位的基本组成: b.复杂转录单位 转录方式不同,拼接方式不同. 三、基因定位 遗传图:基因在染色体上的位 置。 经典方法: ⒈遗传交换定位 ⒉接合定位 ⒊染色体爬行法 基因鉴定的方法:外显子特征 ⒈与RNA 后cDNA 杂交; ⒉Zoo-blot 不同物种杂交; ⒊外显子捕捉; ⒋CG 岛鉴定; ⒌扣除杂交。
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内含子GT/AG 规则: 内含子与外显子连接处的序列特异: 内含子5’端为GT,3 ’端为AG, GT/AG 规则. --------GT--------AG-------- 外显子内含子外显子 B.存在不同的转录单位 a.简单转录单位 转录单位的基本组成: b.复杂转录单位 转录方式不同,拼接方式不同. 三、基因定位 遗传图:基因在染色体上的位 置。 经典方法: ⒈遗传交换定位 ⒉接合定位 ⒊染色体爬行法 基因鉴定的方法:外显子特征 ⒈与RNA 后cDNA 杂交; ⒉Zoo-blot 不同物种杂交; ⒊外显子捕捉; ⒋CG 岛鉴定; ⒌扣除杂交。第四章DNA 复制 第一节 复制概论 ⒈半保留复制 ⒉复制的方向5’→3’ 实验证据:在反应物中加入dNTP。 ⒊具有固定的起始位
⒋DNA 聚合酶 ⒌半不连续复制 一条链连续合成,称主导链Leading Strand; 另一条链分段合成,称随从链(随后链)Lagging Strand。
第二节 DNA复制的酶学 复制体系的鉴定 DNA 基因:与DNA 复制有 关的基因 条件型突变体、温度突变 体研究DNA 基因 快停突变体、慢停突变体 1.DNA 聚合酶 3 种klenow 片段 聚合酶I 活性 ①5’-3’聚合活性 ②3’-5’外切活性 ③5’-3’外切活性 聚合酶Ⅲ:主要的复制酶 聚合酶活性
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