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<<实验动物学>>(10)

时间:2005-12-30 20:56来源:Internet 作者:bioguider 阅读:

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    细菌的种类不同,其DNA中碱基顺序也不相同。细菌的种属差别越大,其DNA中碱基顺序差别亦越大。故通过细菌DNA碱基顺序同源性分析, 即细菌的核酸杂交可以对细菌种、属间的亲缘关系作出分类和鉴定。 
    (1)DNA中G+Cmol%含量相差大于10%,表明它们之间的关系较远,它们的DNA 不能杂交。 
    (2)若两个菌的DNAmol%含量相同,杂交同源性大于70%说明它们关系很近,属于同一个种。 
    (3)若两个菌株的同源性小于25%,杂交物中碱基顺序偏差很高,即使DNAmol% 含量相近,也可以肯定它们不属于同一个种。 
   (六)聚合酶链反应在实验动物细菌学监测中的应用 
    聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)技术是一种在体外模拟自然 DNA复制过程的核酸扩增技术。它以待扩增的两条DNA链为模板,由一对人工合成的寡核苷酸引物介导,通过DNA聚合酶酶促反应,快速体外扩增特异DNA序列。其特异性系由两个人工合成的引物序列所决定。该反应经过变性、复性和延伸约30个循环就可在2 个小时内将靶DNA扩增数百万倍。细菌学检验中,许多实践业已证明,菌细胞可以直接加入PCR反应体系进行基因扩增。根据不同目的和采用不同的方法对PCR扩增产物进行分析,使得细菌快速鉴定更加容易且具灵敏度高、特异性强、操作简便等特点。 
    PCR技术在我国实验动物细菌学监测中,已应用于致病性大肠埃希氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌、假单胞菌、致病性葡萄球菌,结核分枝杆菌等多种致病菌的检测。从而为我国的生命科学研究提供合格的实验动物。 

二、实验动物真菌学监测 
    引起动物皮肤真菌病的病原菌,主要是石膏样毛癣菌、石膏样小孢子菌和羊毛状小孢子菌三种,这三种菌的检查是实验动物皮肤真菌检验的核心内容,不论是从动物皮肤病灶处,或是从非病灶处分离出这三种菌,均视为异常。因为非病灶处的真菌很可能随后引起皮肤病,同时对饲养和实验人员构成了直接威胁。
   (一)检验程序

                菌落观察 涂片镜检    (二)检验方法
    1. 取材  处死动物,用灭菌刀刮取待检动物可疑病灶或易摩擦部位皮毛、 鳞屑少许并尽快进行分离培养。
    2. 分离培养  无菌操作将标本接种于沙氏斜面培养基中,放置28 ℃恒温箱中培养7 -14天,观察菌落形态。   
    3. 涂片镜检  在载玻片上加乳酸酚棉蓝染色液一滴,用接种针(环) 取培养物置染色液中,加盖玻片,镜检。 
    (1)石膏样毛癣菌 在沙氏培养基上,室温一般3-4天开始生长.根据菌珠不同可分为5型。
    Ⅰ型  羊毛状,白色羊毛状菌丝充满整个斜面,背面淡黄色。
    镜检  除单纯菌丝外,有少量小分生孢子,有时可见球拍状菌丝和结节状菌丝,无大分生孢子和螺旋状菌丝。
    Ⅱ型  生长快,表面有白色紧密较短的菌丝,中央可见乳头状凸起,边缘整齐如刀切,背面棕黄或棕红色。   
    镜检  菌丝与Ⅰ型相似,但小分生孢子较多,有时呈葡萄状,无大分生孢子及螺旋状菌丝。
    Ⅲ型  开始为乳白色菌丝,不久产生粉末菌丝,色微黄,中央有少许皱叠,似奶皮,边缘不整齐,背面淡黄或棕黄。
    镜检  可见粗细不一的菌丝,破梳状菌丝、球拍状菌丝、结节状菌丝。小分生孢子较多,呈卵圆形或葡萄状。
    Ⅳ型  粉末状,表面光滑,中央可有少数白色菌丝团,充满斜面,色黄,背面棕红色。
    镜检  与Ⅲ型类似。
    Ⅴ型  呈粉末状,表面有不规则的折叠,边缘不齐,色黄或棕黄,背面棕黄。
    镜检  与Ⅲ、Ⅳ型类似,但大分生孢子多而长。
    (2)石膏样小孢子菌  在沙氏培养基上,初为白色绒毛状, 渐变为棕黄色粉末状。菌落背面为红棕色,边缘不整齐。
    镜检  可见很多大分生孢子,有4-6隔壁,12-13X40-60μm大小,呈纺锤形,壁薄粗糙有刺。菌丝较少。
    (3)羊毛状小孢子菌  在沙氏培养基上,生长快,初为黄色绒毛状, 两周后菌丝较多,呈羊毛状并充满斜面,菌落中央趋向粉末状,颜色由白色渐变为淡棕黄色,背面红棕色。
    镜检  可见直而有隔的菌丝体,以及很多中央宽大、两端稍尖子的纺锤形大分生孢子,25-20X60-125μm大小,壁厚,表面粗糙有刺,多隔,一般4-7隔,偶见12隔。   
    4. 根据分离培养和镜检的结果,对分离到的真菌进行鉴定,必要时作生化及免疫学试验(补体结合试验、荧光抗体测定、ELISA测定抗原、抗体)。
    5. 工作人员的防护   饲养管理和实验人员在与可疑感染真菌的实验动物接触时,必须严格穿戴工作衣帽、口罩、手套,工作完毕用甲醛和高锰酸钾加热消毒空气和器具,以防止病原真菌对环境污染。
    三、实验动物病毒学的监测
    实验动物病毒学监测的目的  一为常规定期对所饲养的动物群抽样检查,以了解动物群中病毒感染情况,动物是否符合原来级别;二为对新引进动物检疫的检查;三为动物群中发生某种疾病或发生传染病流行,要确证病原,采取控制措施,并对患病动物进行病毒病原学检查。
    病毒检测的方法有血清学诊断,病毒病原学检查和分子生物学的方法等。
   (一)血清学诊断方法  
    原理  在病毒感染中由于特异抗原刺激动物机体产生相应的体液免疫(特异抗体),因此用已知的病毒抗原检查动物群体的血清中特异抗体的水平和阳性率,从而测出动物群体对这种病毒的感染情况。
    1. 血标本的制备 穿刺眼腔静脉、或剪断腋下静脉取血分离血清、或定量血按 1:5稀释于含0.5%枸橼酸钠抗凝剂内,收获上清液作为1:10稀释的血清,冻存备用。
    2. 检查方法  目前美国、日本、英国、加拿大等国家所采用的常规方法,有补体结合试验(CF)和血凝抑制试验(HI),间接免疫荧光试验(IFA)和酶联免疫吸附试验(ELISA),放射免疫测定和多种酶免疫试验,视各种病毒对检测方法的敏感性和精确性而选择。根据我国实际情况,常规检测的方法有HI、ELISA、IFA和免疫酶染色试验(IEA), 后者与(IFA) 相似,用免疫酶代替免疫荧光,用普通显微镜便可观察结果。
   (二)病原学检查方法  
    1. 病毒分离培养
    适用于动物群中出现的病例,或疾病流行时需要确证病原,或要检出动物群中的潜在病毒。
    (1)标本的采集  选择发病急性期的动物或濒死的动物在实验室处死检查,根据动物种属、临床症状和大体病理检查,初步诊断,拟出病毒感染类型,用无菌方法采取脏器、血液、粪、尿、鼻咽分泌物或皮肤病灶等标本,即时处理或放低温(-70℃) 暂时保存。死亡过久的动物不宜作病毒分离,如动物现场处理,则应无菌取出标本置于营养液内保存、立即送到实验室。
    (2)选择敏感细胞培养物  鸡胚或敏感动物是病毒分离的重要环节。 根据可能的病毒感染来选择,并尽快接种。
    ①标本接种细胞培养物后观察细胞病变的出现,例如鼠痘病毒、鼠肝炎病毒等,可作血吸附实验,如血吸附阳性,证明有病毒存在。例如仙台病毒,亦可用免疫荧光或免疫酶试验检查病毒抗原在组织培养细胞上的存在。例如LCM病毒,细胞培养物连续三次传代未发现病毒的迹象为阴性,如有病毒可作进一步鉴定。
    ②鸡胚接种  仙台病毒接种鸡胚尿囊腔后,尿液可检出仙台病毒血凝素,痘病毒接种鸡胚绒毛尿囊膜,有痘斑出现。           
    ③标本接种敏感动物  有些病毒缺乏敏感的组织培养细胞,但接种动物敏感,可选择对该病毒敏感的动物和敏感的接种途径,接种后观察动物的发病情况,抗体产生,病理改变和从感染动物再分离病毒或继续传代等。动物接种时亦可用一组已知具有免疫力的动物同时接种作为对照。
    ④动物组织细胞连续培养传代,观察细胞病变的出现或用免疫荧光、免疫酶等方法以证明病毒的存在。
    (3)分离病毒的鉴定
    ①用已知阳性血清检查分离的病毒。可做HI、CF、NT、IFA和IEA 等试验。
    ②用电镜观察  用感染病毒的组织培养细胞的超薄切片,浓缩病毒液的负染检查或免疫电镜检查等。
    ③分离的病毒对疾病病原学意义的分析。结合临床症状,病理检查,病毒的检出率进行分析,将分离的病毒感染同类宿主复制出相似疾病,并用其抗原检查同类急性期病例血清和恢复病例血清的抗体有4倍4或倍以上增长者,即可证实此病毒为本次流行的病原。
    2. 病毒颗粒、病毒抗原和核酸的检出
    用各种方法证明动物机体内或其排泄物中有病毒颗粒或病毒抗原的存在,一般适用于急性病例的检查,可作为快速诊断或其他辅助诊断方法。
    (1)用电镜直接检出组织内或排泄物中的病毒颗粒,发现新的病毒。 亦可用已知阳性血清作免疫电镜检查待检的病毒。
    (2)聚丙烯胺凝胶电泳(PAGE)检查病毒基因组。 例如腹泻动物粪便内轮状病毒被裂解后,在PAGE中出现11条双股RNA片段,有特征性,可鉴别不同组、型的轮状病毒, 本法常被用于腹泻轮状病毒的检查。其它病毒如呼肠3型病毒和肠道腺病毒都有不同的电泳型。因此,根据有特征性的电泳型便可证明标本内有相应病毒的存在。
    (3)核酸分子杂交技术:用已知病毒核酸片段制备的核酸探针,测定待检标本(粪便、细胞和组织内病毒)中有否同源病毒存在,有杂交出现,则表明标本内有相应病毒核酸的存在。常用的方法有原位杂交与点杂交。   
    3. 聚合酶链反应(PCR)技术:提取待检标本中的核酸作模板,用已知相应病毒的一段具有特异性序列的引物,在DNA聚合酶的作用下,扩增病毒DNA片段。PCR 技术已用于实验动物病毒学检测中,如小鼠肝炎病毒、仙台病毒等。在实验动物微生物学监测工作中是一次技术上的革新。   
    4. 潜在病毒的激活
    有些病毒潜伏于机体内,无明显症状,当宿主受到外环境的影响时,体内发生变化,潜在的病毒被激活,出现临床症状,此时病毒易被检出。故可用应激剂(如可的松)或亚致死量X-光照射,免疫抑制剂等作用于动物,而激活潜在病毒,进行检查。
    5. 抗体产生试验
    把待检动物的组织悬液接种于已知无一般常见病毒感染的动物,3~4周后采血,用已知抗原检查有没有相应抗体的存在。
    6. 其他方法
    如乳酸脱氢酶病毒采用测定血清中乳酸脱氢酶(LDH)水平的方法,升高4倍或4倍以上可诊断。
    四、实验动物寄生虫学监测
    寄生虫的感染与环境有密切关系,因为寄生虫在同一宿主体上或仅通过简单媒介即可完成整个生活史,因而随着环境的好坏和改变直接影响感染率。所以寄生虫感染往往是实验动物饲养管理的卫生指标之一。
    寄生虫对宿主的侵害,虫体对动物有不同程度的损害,另一方面宿主对虫体也有所反应,寄生虫和宿主的相互作用使动物生理、生化、免疫指标发生改变,从而影响实验动物的结果。
    实验动物的寄生虫种类繁多。从寄生虫的分类学角度可分为原虫、蠕虫及节肢动物,蠕虫又可分为吸虫、绦虫和线虫。从宿主角度可分为小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠、兔、猫、狗及灵长类的寄生虫。从寄生部位又可分为体内寄生虫与体外寄生虫。
   (一)体外寄生虫检查方法  
    1. 用肉眼观察或借助于放大镜对动物进行仔细观察。体外寄生虫感染严重时,可引起动物脱毛、毛糙甚至由于瘙痒引起溃疡、结痂。检查时尤其注意动物易感染部位,如耳根、颈后、眼周、背部、臀部及腹股沟等。用梳子梳理动物毛发可发现虱、蚤等节肢类寄生虫。
    2. 透明胶带粘取法适用于大、小鼠,将2cm宽的透明胶带剪成与载玻片近等长的胶条,粘取动物毛发查螨。
    3. 被毛检查法  取宿主易感染部位被毛少许,加一滴生理盐水后加盖玻片。 镜下观察有无虫体。
    4. 皮屑刮取法  用刀片刮取宿主感染部位,尤其是出现溃疡或结痂处, 用力刮取深层屑片,置于载玻片上,加两滴10%NaOH溶液使之液化(或两滴甘油使之透明), 加盖玻片镜检。此法适用于疥螨和痒螨的检查。实验动物中寄生螨有很多种,常见的有以下几种。(见表3.6)
   (二)体内寄生虫  
    1. 肠道寄生虫  采取粪便,用肉眼观察有无可见线虫、吸虫或绦虫的节片, 然后将粪便直接涂片检查虫卵,包囊及原虫。也可采用以下方法检查。
    (1)饱和盐水漂浮法  在有粪便标本的漂浮管内加少许饱和盐水调匀; 加饱和盐水至漂浮管3/4处,放置3-5min。挑去粗渣,加饱和盐水至液面高出管口,静置20min;用盖玻片轻轻压于液面,垂直提起,放在载玻片上镜检。  
    (2)离心沉淀法 将标本加入离心管内,以1500r/min离心15min,弃去上清液,将剩余少许液体与沉淀混匀,用吸管吸出滴在载玻片上,加盖玻片镜检。 

              表3.6  几种常见实验动物寄生虫的主要特征
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            鼠 癣 螨       鼠 肉 螨          相似拉德螨      兔 痒 螨
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成虫♀约   0.3x0.17mm     长 0.4-0.5mm       与鼠肉螨相似   约0.7x0.5mm
大小♂约   0.2x0.14mm     长0.28-0.3mm       与鼠肉螨相似   约0.6x0.4mm
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       ♀虫一、二对足    第一对足短小,向前   第二对足末端  ♀虫第三对有较长
主要   简单三、四对足    伸,各足间呈叶状突   有两个不等长  的钢毛无吸盘♂虫
形态   呈黑棕色强几丁    起,第二对足末端无  的爪,其他特  第四足无吸盘,明显
特征   质化、呈钩夹样。  爪仅一爪间垫样结构  征同鼠肉螨    短于第三对足,体后
      ♂虫前三对足与♀   体后端两根长钢毛,                缘成两个叶状突起。
       相同,第四对足粗   ♂虫两毛基距较♀虫                其余各足末端都有  
       壮,向后包绕成抱   近。                钟状吸盘。
       握器, 体后两对        
       长钢毛而♀虫一对。
───────────────────────────────────────
    (3)解剖动物  解剖动物从肠道收集标本。
    2. 组织内寄生虫  在解剖动物时,对疑为寄生虫感染的部位作组织压片、 切片检查。此外用于微生物检查的多种免疫学方法均可检查寄生虫。
    3. 血液寄生虫  实验动物的血液寄生虫极为罕见,从野外捕获或有野外媒介昆虫侵入的饲养环境中的动物不排除血液寄生虫的感染。检查时,采取末稍血、静脉血或骨髓制成厚、薄片,染色后镜检。
    4. 血清学方法  间接血凝试验用于弓形虫的检查。在微孔塑料板上, 以稀释对待检血清作对倍稀释。为排除被检血清与致敏红细胞产生非特异性凝集,每份被检血清滴2行,一行作为测定血凝效价,另一行滴绵羊血红细胞作对照。
    判断结果 在阳性对照孔血清各孔出现凝集,阴性对照血清、 对照绵羊血红细胞和空白对照孔不凝集的前提下,若被检血清抗体滴度≥1:64则判为阳性。
第四章     实验动物营养与饲料质量控制 

    作为被限定饲养于特定环境之中,用于科学研究的一个特定动物种群,实验动物的营养物质需要,对于维持生命与健康,保证生长发育和种群特性,对于保证实验结果的准确性及再现性都是至关重要的。动物的食物即饲料,是动物摄入营养素的主要来源,饲料的质量对实验动物的质量和动物试验的结果均有直接影响。因此,研究动物营养需求、加强饲料的质量管理是实现实验动物标准化的重要条件之一。

         第一节 饲料营养成分及其营养作用

    人们把生物从外界摄取维持自身生命所必需的物质及其消化、吸收和排泄过程称为营养(nutrition)。把动物自发地从外界寻求到的营养物质称为食物(food)。而人类饲喂给的营养物质称为饲料(feedstuff),对食物或饲料中所包含的各种营养物质则统称为营养素(nutrients)。
    自然界中的各种物质均由化学元素所组成,在已知的一百多种元素中,至少有26种为动物所必需,这些元素绝大部分以化合物的形式存在。目前已清楚了解到,动物需要的营养物质达数十种,可以概括为七大类,即蛋白质、脂肪、碳水化合物、矿物质、维生素、纤维素和水。虽然这些物质在各种饲料中的含量有所不同,但其对实验动物的营养作用是一致的。它们各具有独特的营养功能,在机体代谢过程中又密切联系,共同参加、推动和调节生命活动。
    一、水及其营养功能
    水对于动物生存的重要性仅次于氧气,没有水的存在,任何生命活动都无法进行。大部分饲料均含有水分,但不同的种类含水量差异很大。对于植物性饲料,同一种原料由于收割期不同、利用部位不同、加工方法及贮存时间的不同,其水分的含量也不尽相同。
    水是动物体的重要组成部分,同时又是在体内运送各种营养物质和代谢产物的载体,也是体温调节不可缺少的物质。水直接参加生化反应,促进各种生理活动,对维持血液循环、呼吸、消化、吸收、分泌、排泄等生理活动以及新陈代谢的正常进行有重要意义。
    动物对水的需要量受多种因素的制约,如动物种类、年龄、生长性能、环境温度湿度等,因此无法规定动物的需水量。及时获得足够的清洁饮水是动物进行正常代谢、生长、发育和维持健康必不可少的条件之一。
    二、蛋白质及其营养功能

(责任编辑:泉水)
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