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华东理工大学微生物学笔记

时间:2005-12-30 21:43来源:Internet 作者:bioguider 阅读:
第一章绪论
第一节微生物学的研究对象与任务
研究对象--微生物:微生物(Microorganism,,microbe)是一切肉眼看不见或看不清的微小生物的总称。
微生物在生物界的地位:包括属于原核生物的细菌、放线菌、蓝细菌、;
属于真核生物的真菌(包括藻状菌纲、担子菌纲、子囊菌纲、半知菌纲);
以及属于非细胞结构的病毒。微生物学的任务:利用有利的一面为人类造福、变有害为有利。
微生物与人类的关系:疾病、物质的霉变、工农业生产、生态。
第二节微生物学的发展
第一阶段--推测期;
第二阶段--观察期;
第三阶段--生理期;
第四阶段--分子生物学时期。
1944 年,Avery 证明遗传的物质基础为DNA;
1953 年,Watson & Crick DNA 双螺旋结构;
1961 年,Jacob& Monod 操纵子学说;
1972 年,Berg Boyer & Cohen DNA 克隆技术;
1982 年,Prusiner 发现朊病毒;
1985 年Saiki PCR 技术(聚合酶链式反应);
1997 年,Wilmut 克隆羊20 世纪以核酸研究为核心:50 年代双螺旋结构;
60 年代操纵子学说;
70 年代DNA 重组;
80 年代PCR 技术;
90 年代DNA 测序。
人类基因组测序计划提前5 年完成,现由结构向功能转移(后基因组时代(post-genomics))。
从基因组到蛋白质组。
功能基因组学(functional genomics),蛋白质组学(proteome),生物信息学(Bioinformatics)。
模式生物:背景清楚、基因组小、便于测定和分析、可从中获取经验改进技术方法。
第三节我国微生物学的发展
古代对微生物学的认识与利用:酿酒,轮作,种痘。微生物学简况:见课本7-8 页。
第二章微生物形态与结构
Ⅰ原核微生物
第一节细菌细菌的形态和大小
形态:球状、杆状、螺旋状;
大小:以微米为度量单位。
细菌-原生质膜(plasma membrance)、原生质体(protoplast)、原生质。
细菌细胞的一般结构细胞壁(cell wall) 在细胞最外层、多孔性的、具有一定屏障作用,水和某些化学物质可以通过, 但对大分子物质有阻拦作用。功能:韧性、弹性。
化学组成:肽聚糖。1 G+菌G-菌核糖体(ribosome) 
华东理工大学《微生物学教程》上课讲义:
G+菌与G -菌的细胞壁结构 内壁层(2-3nm 肽聚糖层) 外壁层(8-10nm 脂多糖层) 细胞壁为一层(20~80nm 厚的肽聚糖层) 脂多糖:O-侧链(具有抗原性)———核心———脂质(内毒素的毒性中心) G+菌与G -菌的细胞壁组成与结构比较菌性质G+菌G- 肽聚糖含量少(10%) 多(40~90%) 直接连接通过五肽连接链连接方式氨基酸组成D-Glu-NH2 D-Glu DAP L-Lys 有无脂多糖有无脂蛋白无有垣酸细胞壁与革兰氏染色原生质体和球形体原生质体(protoplast):指在人为条件下,用溶菌酶除尽原有细胞壁或用青霉素抑制新生细胞壁的合成后,所留下的仅有一层细胞膜包裹着的圆球状渗透敏感细胞,一般由革兰氏阳性菌形成。脆弱,高渗溶液球形体:指还残留了部分细胞壁的原生质体,一般由革兰氏阴性菌所形成。细胞膜(cell membrane) 紧贴在细胞壁内侧的一层由磷脂和蛋白质组成的柔软、富有弹性的半透性薄膜。功能:主要为控制营养物质及代谢产物进出细胞。组成:磷脂蛋白质。结构:流动镶嵌模型。间体(mesosome) 拟线粒体细胞质(cytoplasm) 被细胞膜包围着的除核质体外的一切透明、胶状、颗粒状物质,可总称为细胞质。主要成分:核糖体、贮藏物、各种酶类、中间代谢物、无饥盐、载色体和质粒等,少数细菌还存在羧化体、伴孢晶体或气泡等构造。65%为核糖核酸,35%为蛋白质。是蛋白质合成的场所。原核生物70S,真核生物80S。2 贮藏物(reserve materials) 
华东理工大学《微生物学教程》上课讲义:
一类有不同化学成分累积而成的不溶性颗粒。在营养过剩时,聚合成各种贮藏颗粒,在营养缺乏时又被分解利用。气泡(gas vacuoles) 存在于许多光能营养型、无鞭毛运动水生细菌中的泡囊状内含物,内中充满气体。外由仅2nm 厚的蛋白质膜所包围,具有调节细胞比重,以使其漂浮在合适水层中的作用,借以获取光能、氧和营养物质。核质体(nuclear body) 又称拟核,指原核生物所持有的无核膜包裹、无固定形态的原是细胞核,是遗传的物质基础。质粒(plasemid) 核外基因(细胞质基因)。质粒的特性:1.环状双链小分子片段;2.决定细菌的某些遗传特性;3.独立自我复制,可转移,能携带一定的遗传信息;4.可自行消失。细菌细胞的特殊结构荚膜(capsule) 某些细菌细胞壁外存在的一层厚度不定的胶状物质。包括微荚膜(<200nm);荚膜(200nm);粘液层(无明显界面);菌胶团(几个菌共有的)。荚膜的主要成分:多糖。荚膜的功能:1.保护细菌(致病菌)免受白细胞的吞噬;2.菌体外的贮存物。有荚膜的菌大多为致病菌;有荚膜菌落为光滑型致病;无荚膜菌落为粗糙型不致病。通过负染色法可观察到鞭毛(flegellum)和菌毛(pilus , fimbria) 鞭毛:长在细菌的体表,着生在细胞膜上的长丝状、曲波的附属物。功能:为细菌的运动器官,运动的支点在细胞壁上。成分:为蛋白质。结构:鞭毛丝,鞭毛钩,基体。观察:显微镜,半固体穿刺。分类:单端鞭毛菌、端生丛毛菌、两端鞭毛菌、周毛菌。鞭毛的位置和数目具有细菌分类鉴定的意义。菌毛:性菌毛,普通菌毛。3 芽孢(endospore spore) 伴孢晶体(parasporal crystal;spore-companioned crystal)
华东理工大学《微生物学教程》上课讲义:
产芽孢的菌有两类:好气:Bacillus(枯草芽孢杆菌属);厌气:Clostridium(梭状芽孢杆菌属)。定义:某些细菌在其生长发育后期,可在细胞内形成的一个圆形或椭圆形、厚臂、含水量低、抗逆性强的休眠构造。芽孢形成过程①束状染色质形成;②细胞膜内陷,细胞发生不对称分裂,其中小体积部分即为前芽孢(forespore);③前芽孢的双层隔壁形成,这时抗辐射性提高;④在上述两层隔壁间充填芽孢肽聚糖后,合成DPA,累积钙离子,开始形成皮层,折光率增高;⑤芽孢衣合成结束;⑥皮层合成完成,芽孢成熟,抗热性出现;⑦芽孢囊裂解,芽孢游离。特性:含水量低,耐热,含DPA-Ca。几种位置和形状: 如何观察: 在形成芽孢的同时,在芽孢旁形成的一颗菱形、方形或不规则形的碱溶性蛋白质晶体。为有毒蛋白质,一般一个细菌产生一个,作为生物农药。例:苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis) 细菌的群体形态菌落(colony):将单个细菌(或其他微生物)或一小堆同种细胞接种在固体培养基的表面(有时为内层),当它占有一定的发展空间并给予适宜的培养条件时,该细胞就会迅速生长繁殖并形成细胞堆,此即菌落。菌落就是在固体培养基上(内)以母细胞为中心的一堆肉眼可见的、有一定形态、构造等特征的子细胞集团。菌落特征:一般呈现湿润、较光滑、较透明、较粘稠、易挑取、质地均匀、以及菌落正反面或边缘与中央部位的颜色一致等。单菌落表面特征群体效应细菌的繁殖无性繁殖:不经过两性细胞的结合,只是营养细胞的分裂或营养菌丝分化而形成同种新个体的过程。裂殖(横分裂法):同型,异型。繁殖的过程:细胞核和细胞质的分裂;横隔壁的形成;子细胞的分离。
华东理工大学《微生物学教程》上课讲义:
立克次氏体(Rickettsia) 处于细菌和病毒之间,但更接近细菌。G-菌特点:具有细胞壁,不能通过细菌滤器;专性细胞内寄生,不能在人工培养基上培养。支原体(Mycoplasma) 介于细菌和立克次氏体之间,是原核生物中最小的,具有致病性。50-60 年代称为PPLO 特点:无细胞壁,可通过细菌滤器;能在人工培养基但条件苛刻(需补充血清);菌落形态似荷包蛋。衣原体(Chlamydia) 介于立克次氏体和病毒之间。以前将衣原体归于病毒,沙眼衣原体特点:具有细胞壁,但能通过细菌滤器,专性细胞内寄生(能量寄生)。支原体、立克次氏体、衣原体和病毒的比较比较项目细胞构造含核酸类型DNA和RNA DNA 和RNA DNA 和RNA DNA 和RNA 核糖体细胞壁细胞膜繁殖时个体完整性大分子合成能力产ATP 系统氧化谷氨酰胺能力对抑制细菌抗生素的反应病毒衣原体立克次氏体支原体无有有有无有有有有(含肽聚糖) 有(不含肽聚糖) 无无有(无甾醇) 有(含甾醇) 无有(无甾醇) 不保持保持保持保持无无有有无无有有无无有有敏感(对抑制细胞有抗性敏感壁合成者例外) 敏感(青霉素例外)
第三章微生物的形态与构造
Ⅱ真核微生物
原核生物与真核生物的比较原核生物即广义的细菌,指一大类细胞核无核膜包裹,只存在称作核区(nuclear region)的裸露DNA 的原始单细胞生物,包括真细菌(eubacteria)和古生菌(archaea)两大类群。其中除少数属古生菌外,多数的原核生物都是真细菌。真核生物是一大类细胞核具有核膜,能进行有丝分裂,细胞质中存在线粒体或同时存在叶绿体等多种细胞器的生物。真菌、显微藻类和原生动物等是属于真核生物类的微生物,故称为真核微生物(eukaryotic micro-organisms)。第一节酵母菌(yeast) 存在的地方:含糖量较高的偏酸性环境(如果园), 利用烃类的酵母菌可在油田或煤油厂附近分离到。用途:理论研究;工业生产:食品工业(馒头发酵酿酒), 制药业(提取核苷酸),作为菌体蛋白;有害的酵母菌:白色念珠菌(口腔溃疡),表皮癣菌属(足癣) 细胞的形态构造:形态:卵圆形,假丝状。大小:比细菌大约十倍
华东理工大学《微生物学教程》上课讲义:
构造: 细胞壁: 葡聚糖(glucan), 甘露聚糖(mannan);细胞膜:甾醇;细胞核:真核(如涂片好能看到的黑点即为细胞核)。繁殖方式: 无性繁殖:芽殖(主要方式),芽裂(产生横隔壁, 较少见),裂殖(二分分裂)。有性繁殖:形成子囊孢子进行有性繁殖,过程: 质配→ 核配→减数分裂(核配形成的双倍体可单独存在,因为双倍体的酵母菌生活力强,所以工业生产上的酵母菌一般为二倍体。) 减数分裂包括二次细胞分裂和一次核分裂。在减数分裂过程中可发生基因重组。菌落特征:易挑起,乳白色,湿润,粘稠,比细菌的菌落大而且厚,酒香味。第二节丝状真菌——霉菌(mold) 营养来源:主要为糖类和少量氮、矿物盐类,极易在含糖的食品(饼干、面堡、各种谷物和水果)上生长。用途:工业上;理论研究。有害的霉菌:食品的霉变等。霉菌的形态结构:与放线菌一样为丝状菌,但菌丝比放线菌粗约10 倍。有单细胞和多细胞之分。菌丝也有三种:基内菌丝,气生菌丝,孢子丝。细胞壁成分:几丁质(为多糖,由N-乙酰葡糖胺通过β-1,4 糖苷键相连而成)。细胞膜:甾醇。霉菌的特征性菌丝: 根霉(假根) 毛霉() 青霉(青霉穗)曲霉(足细胞) 菌落特征:不易挑起,菌落疏松,产色素。繁殖方式:无性繁殖:通过无性孢子繁殖; 有性繁殖:也是三个阶段。第四章微生物的形态和构造Ⅲ非细胞型生物第一节病毒(virion) 病毒的特性:个体极小,只能在电子显微镜下观察到,能通过细菌过滤器;专性活细胞内寄生;无细胞结构。病毒是超显微的、无细胞结构的、专性活细胞内寄生的实体。病毒的两重性:活细胞外具一般化学大分子特征,活细胞内具生命特征。
华东理工大学《微生物学教程》上课讲义:
病毒的形态构造和化学组成病毒的大小:以纳米为单位。病毒的形态:动物病毒:圆形(球形);植物病毒: 杆形;微生物病毒(噬菌体):蝌蚪形。病毒的化学组成:蛋白质(外壳),DNA 或RNA。病毒的结构: 衣壳粒(capsomere) →衣壳(capsid) (蛋白质外壳); 衣壳+核髓(core) (DNA 或RNA)→核衣壳蛋白质外壳的作用:构成病毒粒子外壳,起保护病毒核酸的作用。核髓的作用:贮存病毒的遗传信息,控制病毒的遗传变异、增殖及对宿主的感染性。动物病毒:线状双链DNA 或单链RNA;植物病毒:线状RNA;噬菌体:线状双链DNA。病毒的群体形态包涵体(inclusion body):某些病毒寄生在宿主中会产生在光学显微镜下可见的小体,是病毒或尚未装配的病毒亚基的聚集体,属蛋白质性质,是有毒蛋白,作为生物农药。优点:专一性高;毒性强;使用方便;对人、畜安全;保护环境。噬菌斑(plaque):在菌苔上逐步形成的噬菌体群体,由于其侵蚀宿主细胞的结果,会使菌苔上出现—个个具有一定形状、大小、边缘和透明度的噬菌斑。(nucleocapsid) 第二节病毒的繁殖噬菌体(bacteriophage)的繁殖吸附(adsorption):吸附是特异性的,即在受体细胞上有吸附位点,这样的吸附不仅宿主细胞表面和噬菌体之间形成牢固的化学结合,而且病毒粒子本身在结构上也发生了变化。当宿主细胞发生突变后,就不能被噬菌体吸附. 抗噬菌体菌株。宿主细胞:有吸附点;有调节机制:可以修复细胞壁的微小损伤;修复能力是有限的:一旦被噬菌体大量吸附,细胞就裂解而噬菌体没有增殖(自外裂解) 侵入(pentration) 尾部的酶水解肽聚糖,使细胞壁产生一小孔,注入核酸,而蛋白质外壳则留在细胞的外面。尾鞘可以明显提高噬菌体核酸的注入速率增殖(replication) 核酸的复制;蛋白质的生物合成;噬菌体DNA 一旦进入细胞中,细胞的活动受噬菌体DNA 的支配,细胞核自动裂解成碎片,根据噬菌体的基因复制噬菌体的核酸、蛋白质等外壳成熟(maturity)或装配裂解(lysis)或释放(release) 在固体培养基表面可见噬菌斑;在液体培养基中可见培养物被溶解,培养基变清。8 溶原性细菌(lysogen; lysogenic bacteria)
华东理工大学《微生物学教程》上课讲义
噬菌斑及噬菌体效价(titre):在这里,效价表示每毫升试样中所含有的具侵染性的噬菌体粒子数,又称为噬菌斑形成单位数。一步生长曲线(one-step growth curve) 潜伏期(latent phase),裂解期(rise phase),平稳期(burst size)。当温和噬菌体侵入宿主细菌细胞后,噬菌体DNA 复制,但不合成蛋白质,宿主细胞也不裂解,继续进行正常的分裂繁殖,即在核染色体上整合有前噬菌体并正常生长。在偶尔情况下,某一代发生裂解时放出新的子代噬菌体,故具有潜在释放成熟时菌体的能力。溶原性细菌的特征:稳定遗传,自发裂解,诱发裂解,免疫性。溶原性细菌的复愈:溶源转变。溶原性(lysogeny) 烈性噬菌体(lytic phage); 温和噬菌体(temperate phage)。噬菌体DNA 侵入宿主细胞后,噬菌体DNA 随宿主细胞DNA 复制,噬菌体蛋白质不能合成,宿主细胞也不裂解,继续进行正常的分裂繁殖。原(前)噬菌体(prophage): 第二节亚病毒(subvirus) 类病毒(viroid) 1971 年首次报道;现已鉴定的有20 多种。分子结构:含246~375 个核苷酸的单链环状RNA 分子,没有蛋白质外壳。专性活细胞内寄生。例:马铃薯纺锤形块茎类病毒(PSTV);鳄梨白斑类病毒。卫星RNA(satellite RNA) 依赖辅助病毒(helper virus) 进行复制的小分子单链RNA 片段(拟病毒) 特性:必须依赖辅助病毒才能进行侵染和复制,可干扰辅助病毒的复制。卫星病毒:必须依赖辅助病毒才能复制。9 例:卫星烟草花叶病毒STMV(Satellite tobacco moscire virus)。
华东理工大学《微生物学教程》上课讲义
丁型肝炎病毒(Hepatitis delta virus,HDV)δ肝炎病毒;辅助病毒:乙型肝炎病毒。朊病毒(prion) 是蛋白质侵染因子(protein infection);为疏水蛋白质。1982 年美国斯坦利.普鲁西内尔(S.B. Prusiner)提出;于1997 年获诺贝尔生理学与医学奖。朊病毒病:库鲁病(Kuru);克-雅氏病(CJD,Creutzfeldt-Jakob disease);GSS 综合症( Gerstmann-Straussler-Scheinker);致死性家族失眠症(FFI,fatal familial insomnia)。潜伏期长人的朊病毒病三种形式:传染型,遗传型,散发型。第三节病毒与实践噬菌体与发酵工业噬菌体的分离培养:分离;纯化;制备;噬菌斑及效价测定。噬菌体的防治: 污染的原因:生产菌株本身;环境及发酵罐本身;空气过滤器;环境;操作人员。防治:识别:正确的判断,普及知识;消灭污染源:罐及管道的死角,控制活菌体的排放(摇瓶,排气),净化环境,筛选抗噬菌体菌株。病毒与人类的疾病干扰素1957 年发现,为糖蛋白,由大多数脊椎动物对病毒感染应答产生, 天然的抗病毒物质。干扰素诱导剂作用于活细胞后,由活细胞产生的一种蛋白质,当它再作用于其它细胞时,该细胞即可获得抗病毒和抗肿瘤等方面的免疫力干扰素的作用机制蛋白质和病毒核酸结合. 抑制病毒的反转录干扰素的种类α- 干扰素:白细胞干扰素β- 干扰素:成纤维细胞干扰素γ- 干扰素:免疫干扰素(是由淋巴细胞接受抗原刺激而产生的)。天然产生的很少, 一般是由基因工程菌产生的人类的病毒病一般的病毒病:天花;小儿麻痹症(脊髓灰质疫苗);肝炎(乙肝疫苗、甲肝疫苗);脑膜炎。理想的药物不多,一般注射疫苗加以预防。肿瘤:1911 年,病毒可以使鸡致癌。现在认为人体存在癌基因,癌基因有防癌的作用,但当它发生细胞突变时,其结构发生变化, 失去抑制细胞生长的能力,从而导致癌变。艾滋病(Aids):全称为人类获得性免疫缺陷综合症(Acquired Immune Dificiency Syndrome), 由人体免疫缺损病毒(HIV)引起。1987 年定名。
华东理工大学《微生物学教程》上课讲义
HIV 病毒为球形。有两种:HIV-1 危害人体(9 型,A B C D E F G H O)。致病原理: 正常的免疫系统:抗原传递给T 细胞.B 细胞.产生抗体。HIV 病毒与T 细胞相似,从而破坏了正常的免疫系统,由于没有了抗体,故表现出抵抗力差。原先寄生于中非猴类上的小小病毒1981 年首先在中美洲发现1983 年从病原体上分离到了该病毒1987 年定名为HIV 治疗:疫苗:灭活疫苗,重组疫苗。药物:AZT(叠氮脱氧胸腺嘧啶核苷)。传播途径:不正常性行为,血液,注射器,母婴传给幼儿。防止策略:抑制病毒HIV 的增殖,增强机体的免疫力,杜绝传播途径。病毒在基因工程中的应用只有一半左右的基因参与其生命活动,因此可插入分子量较大的DNA 片段。λ噬菌体:科斯质粒(cosmid): λ噬菌体的粘性末端和质粒构建而成。特点:感染力强;cos 位点连接形成环状,似质粒;可克隆大片段。用途:理论研究;包涵体:昆虫病毒的多角体用于生物防治;吞噬绿脓杆菌。危害:工业发酵的污染;人类的疾病。光能碳源\能源光能异养型有机物光能自养型无机物第五章微生物的营养和培养基营养(nutrition):生物体从外部环境中摄取对其生命活动必须的能量和物质,以满足正常生长和繁殖需要的一种最基本的生理功能。营养物(nutrient):具有营养功能的物质。第一节微生物的六种营养要素细胞的化学组成:元素:C、H、O、N、矿物元素;存在形式:有机物、无机物。微生物是杂食性的:一般生物能利用的,微生物能利用;一般生物不能利用的,微生物也能利用;一般生物有害的,微生物还能利用。微生物的营养要素:碳源、氮源、能源、生长因子、无机盐、水。碳源(carbon source):有机碳源:淀粉、葡萄糖等;无机碳源:Na2CO3 等。葡萄糖、乳糖的二次生长。氮源(nitrogen source):有机氮源:蛋白胨、黄豆粉、玉米浆;无机氮源:NH4NO3、(NH4)2SO4; 速效氮源,迟效氮源。能源(energy source):化学物质,辐射能。生长因子(growth factor):有三类:氨基酸,维生素,核苷酸。无机盐:提供矿物元素和微量元素。水:水是良好的溶剂;生化反应在水中进行;水的比热大。第二节微生物的营养类型划分依据:碳源和能源。化学能化能异养型化能自养型
华东理工大学《微生物学教程》上课讲义:
单纯扩散(simple diffusion) 氧、二氧化碳、乙醇、某些氨基酸等小分子; 亲脂性分子从高浓度到低浓度的扩散来运输它利用细胞膜的通透性,细胞膜是一道屏障。又称被动运输(passive transport)
促进扩散(facilitated diffusion) 需要特异性载体蛋白(carrier protein),即渗透酶(大多为诱导酶)。每种载体蛋白运输相应的物质。从高浓度到低浓度。原理:利用膜内、膜外被运输物质和载体蛋白的亲和力的不同。
第三节营养物质进入细胞的方式营养物质的吸收与代谢产物的分泌,涉及到物质的运输,而关键是细胞膜。运输:不耗能运输(单纯扩散,促进扩散);耗能运输(主动运送,基因移位)。主动运送(active transport) 是微生物吸收营养的主要方式。需要特异性载体蛋白需要能量来改变载体蛋白的构象。是逆浓度梯度的运输。基团移位(group translocation) 在运输过程中,物质分子发生了化学变化。每输入一个葡萄糖分子,就要消耗一个ATP 的能量。 
华东理工大学《微生物学教程》上课讲义:
第四节培养基培养基(medium,culture medium):是一种人工配制的、适合微生物生长繁殖或产生代谢产物用的混合养料。选用和设计培养基的原则和方法四个原则:目的明确(根据不同微生物的营养需要配制不同的培养基);营养协调(注意营养物的浓度和配比,特别是碳氮比( C/N ));物理化学条件适宜(PH、渗透压、水活度); 经济节约。四种方法:生态模拟,查阅文献,精心设计,试验比较。培养基的种类及其应用按对培养基的了解来分天然培养基(complex medium, undefined medium),较经济,一般用于大规模生产组合培养基(defined medium)或称合成培养基(synthetic medium),较昂贵,一般用于研究工作(代谢、遗传分析),特点:组份精确,重复性好。按培养基外观的物理状态来分固体培养基(solid medium),一般加有凝固剂,凝固剂含量一般为1~2% 作为凝固剂的条件:不被微生物分解利用,生长温度范围内保持固体状态,凝固点温度对微生物无害,不因灭菌而破坏,透明度好、配制方便、价格低。用途:由于固体培养基能提供表面,形成单菌落,因此可用于:菌种分离、鉴定、保藏等半固体培养基(semi-solid medium),凝固剂含量一般约为0.5% 用途:观察细菌的运动,测定噬菌体效价等。液体培养基(liquid medium),培养基中没有凝固剂。用途:大量培养微生物,研究生理代谢等。按培养基的功能来分选择培养基(selected medium) 用途:将混合军中所需的目的微生物分离出来加富培养基(enriched medium) 鉴别培养基(differential medium) 用途:细菌学检验遗传研究第六章微生物的代谢和发酵新陈代谢(metabolism)简称代谢,是指发生在活细胞中的各种分解代谢(catabolism)和合成代谢(anabolism)的总和。即新陈代谢=分解代谢+台成代谢分解代谢又称异化作用,是指复杂的有机物分子通过分解代谢酶系的催化产生简单分子、能量(一般以腺苷三磷酸即ATP 形式存在)和还原力(或称还原当量,一般用[H]来表示)的作用。合成代谢又称同化作用,与分解代谢正好相反,是指在合成代谢酶系的催化下,由简单小分子、ATP 形式的能13 初级代谢: 次级代谢: 第一节微生物的能量代谢华东理工大学《微生物学教程》上课讲义量和[H]形式的还原力一起,共同合成复杂的生物大分子的过程。最初的能源(primary energy sources): 有机物,还原态无机物,日光辐射能。通用能源(universal energy source): ATP。生物氧化:脱氢、递氢、受氢。发酵:基质为有机物,最终电子受体为有机物。葡萄糖→ 丙酮酸(EMP 途径) 产生2 个ATP( 底物水平磷酸化) 由于基质氧化不彻底,发酵的结果仍积累有机物,所以产生的能量较少。例:葡萄糖→ 丙酮酸→乳酸,产生54 kcal 的能量不同的微生物发酵可产生不同的产物,例:葡萄糖→ 丙酮酸→乳酸or 乙醇or 丙酮丁醇有氧呼吸:彻底的氧化过程。基质为有机物,最终电子受体为分子氧。葡萄糖→CO 产生38 个ATP,其中底物水平磷酸化产生2 个ATP,氧化磷酸化产生36 个ATP EMP 途迳:葡萄糖→丙酮酸;丙酮酸→乙酰CoA(氧化脱羧体系);TCA 循环。电子传递链无氧呼吸: 基质为有机物,最终电子受体为无机物。C6H12O6+12KNO3→6CO2+12KNO2+6H2O + 429kcal 三种生物氧化方式的产能水平比较2 + H2O 
华东理工大学《微生物学教程》上课讲义:
最高:有氧呼吸,第二:无氧呼吸, 最低:发酵。“鬼火”的生物学解释: 在无氧条件下,某些微生物在没有氧、氮或硫作为呼吸作用的最终电子受体时,可以磷酸盐代替,其结果是生成磷化氢(PH3),一种易燃气体。当有机物腐败变质时,经常会发生这种情况。若埋葬尸体的坟墓封口不严时.这种气体就很易逸出。农村的墓地通常位于山坡上,埋葬着大量尸体。在夜晚, 气体燃烧会发出绿幽幽的光,长期以来人们无法正确地解释这种现象,将其称之为“鬼火”。烃类化合物的分解烃类化合物主要是被氧化,是一个绝对需氧的过程,在缺氧条件下,烃类完全不受微生物影响。(所以地下沉积的石油会长期不变) 能分解烃类的微生物:细菌(假单胞菌,分枝杆菌,棒状杆菌);放线菌(链霉菌,诺卡氏菌);酵母菌。一般在油田及炼油厂附近都能分离到。应用:萘被假单胞菌利用生成水杨酸;丙烯氰生成丙烯酰胺;石油脱蜡;石油代替粮食发酵; 石油探测。绝对好氧:优点:石油不被破坏;缺点:发酵过程需通入大量氧气,消耗动力;发酵培养基中需要加乳化剂(因为烃类石油类物质,与水不相容)。第二节生物固氮固氮生物:能使氮分子还原成氨的生物。一般均为原核生物,于1888 年分离到。能固氮的微生物:自生固氮菌,共生固氮菌,联合固氮菌。固氮的生化机制:固氮反应的必要条件:固氮酶(nitrogenase),能量(ATP),还原力,严格的厌氧微环境。固氮的生化途径:N2+8[H]+18~24ATP→2NH3+H2+18~24ADP+18~24Pi 
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第七章微生物的生长及其控制生长(growth):个体体积或重量的变化;繁殖(reproduction):个体数量的变化。个体生长→个体繁殖→群体生长;群体生长=个体生长+个体繁殖。生长和繁殖是交替进行的。衡量群体生长的量:重量、体积、密度、浓度、个体数目等。第一节测定生长繁殖的方法纯培养的分离法自然界中的微生物都是杂居在一起的,每种微生物的生长情况是不同的。纯种分离:稀释到平皿法;平板划线分离法; 单细胞挑取法;利用选择培养基分离法。微生物生长的测定测定生长量:测体积;称干重;比浊法;生理指标法(测含氮量;测含碳量;测磷、DNA、RNA、ATP。) 测细胞的个数:比例计数法、血球计数法、平板活菌计数法。
第二节微生物的生长规律细菌的个体生长和同步生长。研究细菌个体的生长方法:用电子显微镜观察细胞的超薄切片; 同步培养(synchronous culture):使群体中的所有个体细胞尽可能的处于同样细胞生长和分裂期中。同步生长(synchronous growth):通过同步培养使细胞群体处于分裂步调一致的状态。获得同步生长的方法:选择法,诱导法。典型生长曲线(growth curve) 四个阶段: 延滞期、指数期、稳定期、衰亡期。16 华东理工大学《微生物学教程》上课讲义生长速率常数(growth rate constant):每小时分裂的代数R。延滞期(lag phase) 特点:生长速率常数为零,代谢活跃,对外界不良环境敏感,细胞变大,RNA(特别是rRNA) 含量增高。如何缩短延滞期:种龄,接种量,培养基成分。指数期(exponential phase) 特点:生长速率常数最大,代时(generation time)最短,细胞平衡生长,酶系活跃,代谢旺盛。作为发酵生产的良好种子,可缩短延滞期。稳定期(stationary phase) 特点:生长速率常数为零,菌体产量达最高点,菌体产量与营养物消耗有一定的比例关系。稳定期到来的原因:营养物耗尽,营养物比例失调,积累了有害代谢产物,理化条件不适宜。如何延长稳定期:补料(增加养料,调节PH)。细胞开始贮存糖原、异染颗粒和脂肪等贮藏物,芽孢杆菌开始形成芽孢,积累次级代谢产物。初生代谢物(primary metabolites),次生代谢物(secondary metabolites),稳定期产物(idiolites),菌体生长期(trophophase),代谢产物合成期(idiophase)。衰亡期(decline phase;death phase) 特点:负生长,菌体自溶。如何利用生长曲线指导生产?种龄:利用对数生长期的种子;延长稳定期;确定放罐时间。微生物的连续培养:单(分)批培养(batch culture), 密闭培养(closed culture),连续培养(continuous culture),开放培养(open culture)。恒浊器(turbidostat) 改变培养基的流速,以控制菌的浓度恒定。微生物在恒浊器中始终以最高的生长速率进行生长。用于获得大量菌体、与菌体生长相平行的代谢产物的生产。恒化器(chemostat;bactogen) 培养基的流速恒定,以某一营养物为生长限制因子。用于与生长速率相关的理论研究。单级连续培养器(one-step continuous fermentor): 代谢产物的生产速率与菌体生长速率平行。多级连续培养器(multi-step continuous fermentor): 代谢产物的生产速率与菌体生长速率不平行。连续发酵(continuous fermentation) 连续培养用于生产实践时,就称为连续发酵连续培养的优缺点优点:高效,便于自动控制,产品质量稳定。缺点:菌种易退化,易污染杂菌,培养基利用率低。高密度培养(high cell-density culture) 基因工程菌提高产物的比生长率:单位时间单位体积内的产物量。提高分离提取的效率(下游工程down-stream processing)。关键问题:补料,提高溶解氧浓度。
17 第三节影响微生物生长的主要因素温度从两个方面来看: 温度上升,反应速率加快,生长速率加快;温度上升,蛋白质、核酸被破坏。微生物的生长有一个温度范围,在这个范围内有一个生长的最适温度、最低温度和最高温度。最适温度:菌代时最短,生长速率最高。氧气专性好氧菌(strict aerobe) , 兼性厌氧菌(facultative aerobe) , 微好氧菌(microaerophilic bacteria),耐氧菌(aerotolerant anaerobe),厌氧菌(anacerobe)。好氧生物因为有SOD,因此剧毒的超氧阴离子自由基(O2·- ) 被歧化成毒性稍低的H2O2 , 在过氧化氢酶的作用下,H2O2 再变成无毒的H2O。PH 最适PH,最低PH,最高PH。PH 的影响:影响营养物的离子化程度,影响环境中有毒物质对微生物的粗性,影响代谢反应中各种酶的活性。 华东理工大学《微生物学教程》上课讲义物理杀菌因素的代表——温度利用高温杀菌:干热灭菌(焚烧灭菌,灼烧灭菌);湿热灭菌(煮沸消毒法,高压蒸汽灭菌法,间歇灭菌法,巴斯德消毒法) 化学杀菌剂或抑菌剂表面消毒剂(重金属盐类:红汞; 有机化合物:酚类、醇类、酸类、醛类;氧化剂:卤素及其化合物; 表面活性剂:新洁尔灭,肥皂;染料:龙胆紫;气体:环氧乙烷)。抗代谢药物的代表——磺胺类药物第四节有害微生物的控制灭菌(sterilization):采用强烈的理化因素使任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施,称为灭菌。消毒(disinfection):采用较温和的理化因素,仅杀死物体表面或内部一部分对人体或动植物有害的病原菌,而对被消毒的对象基本无害的措施。防腐(antisepsis):利用某种理化因素完全抑制霉腐微生物的生长繁殖,即通过制菌作用(becteriostasis)防止食品、生物制品等对象发生霉腐的措施。化疗(chemotherapy):利用具有高度选择毒力(selective toxicity)即对病原菌具高度选择毒力而对其宿主基本无毒的化学物质来抑制宿主体内病原微生物的生长繁殖,借以达到治疗该宿主传染病的一种措施。抗代谢药物一类在化学结构上与细胞内必要代谢物的结构相似,并可干扰其正常代谢活动的化学物质。SMZ:磺胺二甲恶唑(sulfamethoxazole)
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抗生素抑制细胞壁的形成-青霉素(青霉素不能口服,它不耐酸,在胃中被降解); 影响细胞膜的功能-多粘菌素; 干扰蛋白质合成-链霉素; 阻碍核酸的合成-博莱霉素。微生物的抗药性。微生物对环境的适应性产生钝化酶;改变细胞膜的透性;细胞内被药物作用的部位发生改变。利用抗药性来指导生产例:如何利用抗磺胺类药物的菌株生产对氨基苯甲酸? 磺胺对氨基苯甲酸如果对氨基苯甲酸增加,磺胺药疗效降低,所以寻找抗磺胺药的菌株就可增加对氨基苯甲酸的产量。第八章微生物的遗传变异和育种遗传性:亲代具有把他所有的形状给子代的特性。变异性:子代具有改变亲代遗传性状的特征。遗传型(genotype),表型(phenotype),变异(varition),饰变(modification)。
第一节遗传变异的物质基础三个经典实验: 转化试验:1928 年,F. Griffith,肺炎双球菌, Streptococcus pneumoniae。1944 年,O.T.Avery DNA RNA 蛋白质多糖DNA+DNA 酶RⅡ RⅡ RⅡ RⅡ RⅡ 少量SⅢ - - - ___ 噬菌体感染试验:1952 年,A. D. Hershey(侯喜) M. Chase(蔡斯) 病毒的重建试验: 1956 年,H. Fraenkel-Conrat (弗朗克-康勒脱) 噬菌体感染试验和病毒的重建试验的说明图见下页
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朊病毒的发现和思考:蛋白质是否是遗传的物质基础?prpsc,蛋白质折叠。DNA 的结构基本单位是核苷酸:核糖(戊糖)+碱基+磷酸。碱基有四种:腺嘌呤(A),鸟嘌呤(G),胸腺嘧啶(T), 胞嘧啶(C)。单链上的碱基不受配对的限制,决定了遗传的多样性。半保留的自我复制保证了生物遗传的相对稳定。第二节基因突变和诱变育种20 基因突变(gene mutation):突变细胞的遗传物质的分子结构或数量发生可遗传的变化。突变的类型: 营养缺陷型(auxotroph)菌株:野生型菌株发生基因突变而丧失合成一种或几种生长因子的能力,从而不能在基本培养基上生长的变异菌株。抗性突变型(resistant mutant)菌株:野生型菌株发生基因突变而对某化学药物或致死物理因子产生抗性的菌株。
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条件致死突变型(conditional lethal mutant)菌株:菌株发生基因突变后,在某种条件下可正常生长,而在另一种条件下无法生长。形态突变型(morphological mutant)菌株:菌株发生基因突变,而在个体形态或菌落形态上发生突变的菌株。抗原突变型(antigenic mutant)菌株:菌株发生基因突变,而在细胞抗原结构上发生变异的菌株。产量突变型(metabolite quantitative mutant)菌株:菌株发生基因突变,在代谢产物产量上明显有别于原始菌株的突变株。正变株(plus-mutant);负变株(minus-mutant)。突变率(mutation rate):一个细胞每一世代某一性状突变的几率;群体中每一世代(分裂一次)产生突变的个数。突变率:10-8 基因突变的特点: 不对应性:突变的性状与引起突变的原因之间没有直接的对应关系; 自发性(10-6~10-9);稀有性;独立性;可诱变性;稳定性; 可逆性:回复突变(reverse(back)mutation)。证明基因突变自发性和不对应性的实验: 变量试验(fluctuation test):波动试验、彷徨试验;1943 年;S. E. Luria& M. Delbruck。涂布试验:1949 年,H.B.Newcombe 影印平板培养法(replica plating):1952 年,J. Lederberg 微生物产生抗药性的途径: 基因突变而产生抗药性; 抗药性质粒的获得(R 因子); 生理上的适应。基因突变及其机制: 右图为突变的类型。
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诱变(induced mutation): 碱基的置换(substitution),转换(transition),颠换(transversion)。两个例子:亚硝酸;5-溴尿嘧啶(碱基类似物base analog)。移码突变(frame-shift mutation phase-shift mutation) 
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染色体畸变(chromosomal aberration) 转座(transposition):DNA 序列通过非同源重组的方式,从染色体某一部位转移到同一染色体的另一部位或其它染色体上的某一部位。转座因子(transposable element):具有转座作用插入序列(insertion sequence,IS);转座子(transposon,Tn); 转座噬菌体(transposable phage) 自发突变(spontaneous mutation):由微生物自身有害代谢产物引起;由DNA 复制过程中碱基配对错误引起;由背景辐射和环境因素引起。遗传密码改变的表型效应: 
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紫外线对DNA 的损伤及其修复紫外线(ultraviolet ray)对DNA 的损伤;嘧啶二聚体; 光复活作用(photo reactivation,photo restoration) 切除修复(excision repair) 突变与育种自发突变与育种( Breeding by spontaneous mutation) 从生产中育种;定向培育优良菌株。自然选育的目的:维持原有的产物的合成水平(稳产);诱变后的菌株群体中表现出各种生理特性需要纯化。诱变育种(breeding by induced mutation) 诱变育种的几个方向:提高产量;改进产品质量;产生新的生物活性物质诱变育种的基本环节(左图所示) 出发菌株→诱变→初筛→复筛→放大→获得优良变异株。诱变育种两个主要的环节:诱变(induced mutation);筛选(screening)。诱变育种中的几个原则: 诱变剂的选择:简便有效; 诱变剂的种类:物理诱变剂,化学诱变剂,拟辐射物质(radiomemetic chemical); 诱变剂量的选择:存活率或死亡率曲线,剂量-诱变率曲线; 出发菌株(original strain)的选择:处理细胞所处的状态,一般为单孢子悬液; 表型延迟(phenotype lag):遗传型虽已突变,但表型却要经染色体复制、分离和细胞的分裂后才表现出来。利用复合处理的协同效应(synergism);利用和创造形态、生理和产量之间的相关指标;设计高效的筛选方法:推理选育。突变株的筛选:产量突变株的筛选,抗药性突变株的筛选,营养缺陷型菌株的筛选
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营养缺陷型突变株:野生型菌株(wide type strain);原养型(prototroph); 回复突变株(back mutant, reverse mutant);基本培养基(minimum medium,MM); 补充培养基(supplemented medium,SM);完全培养基(complete medium,CM)。前体1→A→B→C→D→前体2 途径α β γ 酶↑ ↑ ↑ a b c 基因一个基因一条多肽链筛选营养缺陷型菌株的四个环节: 诱变;淘汰野生型(抗生素法,菌丝过滤法);检出缺陷型(夹层培养法,限量补充法,逐个检出法,影印平板法);鉴定缺陷型(生长谱法)。维生素的生长谱营养缺陷型菌株的应用:赖氨酸,研究代谢途径。氨基酸的生长谱
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研究代谢途径: 粗糙链孢霉(Neurospora crassa) 瓜氨酸- + + 鸟氨酸- - + 突变株Ⅰ 突变株Ⅱ 突变株Ⅲ 精氨酸+ + + 前体→鸟氨酸→瓜氨酸→精氨酸→.. 艾姆氏试验(Ames test):生物的遗传物质是核酸;凡对微生物有效的诱变剂对高等动物同样有效;化学药剂对细菌的诱变率与其对动物的致癌率成正比;凡致癌物质都是诱变剂,但并非所有的诱变剂都能致癌;95%的致癌剂有诱变作用, 约90%的非致癌剂就没有诱变剂的作用。材料:鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型菌株,老鼠肝脏抽提液。
第三节基因重组和基因杂交基因重组(gene recombination) 遗传重组(genetic recombination):两个独立基因组内的遗传基因,通过一定的途径转移到一起,形成新的稳定基因组的过程。原核生物的基因重组转化(transformation) 转导(transduction) 接合(conjugation, mating) 原生质体融合(protoplast fusion) 转化:受体菌直接吸收来自供体菌的DNA 片段,通过交换把他整合到自己的基因组中,从而获得供体菌部分遗传性状的现象。受体细胞(recipient cell, receptor) 供体细胞(donor cell) 转化子(transformant) 
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感受态:受体细胞最易接受外源DNA 片段并实现转化的生理状态。转化的过程:感受态细胞吸收DNA;DNA 掺入细胞后的整合。转化的要求:受体细胞处于感受状态(competence) 转化的特点:直接吸收;受体细胞处于感受态转染(transfection) 转导:通过缺陷噬菌体的媒介,将供体细胞的DNA 片段携带入受体细胞中,通过交换和整合, 使后者获得前者的部分遗传性状。缺陷噬菌体(defective phage) 转导子(transductant) 普遍性转导(generalized transduction):完全缺陷噬菌体。特点:随机包裹;转导子非溶原性。局限性转导(specialized transduction):部分缺陷噬菌体。特点:转导的是特定基因;转导子为缺陷溶原性。普遍性转导和局限性转导的比较普遍性转导和局限性转导的比较普遍转导任何基因能转导的基因不结合到寄主上噬菌体在寄主中的位置获得转化噬菌体的方式转导子的区别通过敏感菌的裂解非溶原性特定基因结合到寄主上通过溶源菌的诱导部分溶原性
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溶源转变lysogenic conversion 接合:供体菌(F+菌株,雄性菌株)通过性菌毛与受体菌(F-菌株,雌性菌株)直接接触,把F 质粒或其携带的不同长度的核基因组片段传递给后者,使后者获得若干新的遗传性状。F+菌株;F-菌株;Hfr 菌株;F’菌株。特点:两细胞直接接触;需要性因子性因子可通过接合获得。原生质体融合:通过人工的方法,使遗传性状不同的两个细胞的原生质体进行融合,从而获得兼有两亲本遗传性状的重组子。原生质体技术的优越性:去掉了细胞壁的障碍,亲株基因组可直接融合、交换,并为链霉菌实现基因转化创造了条件;二亲株的基因组之间可发生多次交换,得到多种类型的重组子, 且参与融合的亲株不限于一个,可以多至3、4 个;重组频率高;可用诱变的方法直接处理原生质体,提高突变率;再生成细胞壁的过程常伴随治理的消除,使染色体发生改变;极其简单,操作方便,不需要贵重药品。
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如何得到原生质体:菌体(菌丝)培养;细胞壁的去除;原生质体的融合(再生); 检出重组子。再生频率的计算: 原生质体数H-原生质体数水再生频率=———————————— 原生质体总数(血球计数) 原生质体技术的应用:利用原生质体形成及再生达到改良亲本的目的(大环内酯类抗生素);利用原生质体诱变提高突变率(庆大霉素);利用原生质体融合获得性的抗生素(Indolizomycin);利用再生,得到了产量提高的变异菌株,例如生二素链霉菌(Streptomytece ambofaciens)通过原生质体再生,螺旋霉素的生产能力提高了三倍多。质粒消除的结果常常导致细胞染色体的改变,或使次级代谢途径发生变化(白霉素和金丝霉素),出现有利于提高抗生素产量的变异菌株。有效的种间融合,使两个产生不同抗生素菌株的调节基因和结构基因重组在一起,诱发一些原来为“沉默基因’的表达,从而产生新物质。同时种间融合还可能使两个产生不同抗生素菌株的结构基因重组而产生杂种抗生素。真核微生物的基因重组有性杂交(sexual hybridization) 准性杂交(parasexual hybridization) 同种而不同菌株的体细胞间发生的融合,常见于半知菌类。准性杂交过程:菌丝联结(anastomosis);形成异核体(heterocaryon);核融合(nuclear fusion);体细胞交换(somatic crossing-over)和单倍化。第四节基因工程基因工程(gene engineering) 遗传工程(genetic eng ineering):人工的离体的分子水平上的遗传重组技术。基本操作:获取目的基因;优良载体的选择; 目的基因与载体DNA 的体外重组;重组载体导入受体细胞(转化);重组受体细胞的筛选和鉴定;工程菌的表达。
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对质粒载体的要求:是一个独立的复制子;具有较多的单一限制性内切酶位点;有方便的筛选标记;具有外源DNA 片段插入失活的附加标记;高拷贝数。应用: 生产多肽类药物:干扰素(interferon),白细胞介素( interleukin ); 生产疫苗:乙肝疫苗; 改造传统工业发酵的菌种; 改良动植物的特性; 用于环境保护的“超级菌”的构建。工程菌的不稳定性。
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第五节菌种的衰退、复壮和保藏菌种的衰退和复壮衰退(degeneration):菌种的特性发生了负变,如生长速度减慢、代谢产物合成能力下降。菌种衰退的原因:自发突变。衰退的防止:控制传代次数;创造良好的培养条件;利用不易衰退的细胞传代; 采用有效的菌种保藏方法。复壮:从已衰退的群体中筛选出少数没有退化的个体。菌种的复壮:纯种分离法(pure culture isolation),包括菌落纯(pure culture in colony lever)和菌株纯( pure culture in strain lever ); 通过寄主体复壮。菌种的保藏菌种保藏的意义:菌种是一个国家极其重要和宝贵的生物资源。菌种保藏的原理:通过保持培养基营养成分在最低水平,缺氧状态,干燥和低温, 使菌种处于“休眠”状态,抑制其繁殖能力。菌种保藏的方法: 斜面冰箱保藏法:斜面保藏是一种短期、过渡的保藏方法,用新鲜斜面接种后, 置最适条件下培养到菌体或孢子生长丰满后,放在4℃冰箱保存。一般保存期为三个月到六个月沙土管保藏法:适合于产孢子或芽孢的微生物。将斜面孢子制成孢子悬浮液接入沙土管中或将斜面孢子刮下直接与沙土混合,置干燥器中用真空泵抽干,放在冰箱内保存。一般保存期为1 年左右。菌丝速冻法:对于不产孢子或芽孢的微生物,一般不能用沙土管保藏。为了方便可以采用甘油菌丝速冻法。由于该法的保藏温度为-20℃,为了避免微生物受损伤致死,需要甘油作为保护剂。甘油的最终浓度为25%。石蜡油封存法:向培养成熟的菌种斜面上,倒入一层灭过菌的石蜡油,用量要高出斜面一厘米,然后保存在冰箱中。此法可适用于不能利用石蜡油作碳源的细菌、霉菌、酵母等微生物的保存。保存期约一年左右。真空冷冻干燥保藏法:目前常用的较理想的一种方法。在真空中使水分升华。微生物的生长和代谢都暂时停止,不易发生变异。菌种保存时间一般5年左右。需要一定的设备。保护剂一般采用脱脂牛奶或血清等。保护剂的作用可能是在冷冻干燥的脱水过程中代替结合水而稳定细胞成分(细胞膜)的构型,防止细胞膜因为冻结而破坏。保护剂还可以起支持作用,使微生物疏松地固定在上面。液氮超低温保藏法:适用范围最广的微生物保藏法。尤其是一些不产孢子的菌丝体,用其它保藏方法不理想,可用液氮保藏法,其保存期最长。原理:用液氮能长期保存菌种。这是因为液氮的温度可达-196℃,远远低于其新陈代谢作用停止的温度(-130℃),所以此时菌种的代谢活动已停止,化学作用亦随之消失。需要保护剂,常用的保护剂为10%甘油。先将菌液降温到0℃,再以每分钟降低1℃的速度,一直降低到-35℃,然后才把装有菌液的安瓿管放入液氮罐的气相中。国内菌种保藏机构中国微生物菌种保藏管理委员会(China Committee for Culture Collection of 
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Microorganisms. CCCMS)委托中国科学院负责担负全国菌种保藏管理业务,下设六个菌种保藏管理中心。l)普通微生物菌种保藏管理中心(CCGMC) 中国科学院微生物研究所,北京(AS):真菌,细菌。中国科学院武汉病毒研究所,武汉(AS—IV):病毒。2)农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC) 中国农业科学院土壤肥料研究所,北京(ISF)。3)工业微生物菌种保藏管理中心(CICC) 轻工业部食品发酵工业科学研究所,北京(IFFI)。4)医学微生物菌种保藏管理中心(CMCC) 中国医学科学院皮肤病研究所,南京(ID):真菌。卫生部药品生物制品检定所,北京(NICPBP):细菌。中国医学科学院病毒研究所,北京:病毒。5)抗生素菌种保藏管理中心(CACC) 中国医学科学院抗生素研究所,北京(IA)。四川抗生素工业研究所,成都(STA):新抗生素菌种。华北药厂抗生素研究所,石家庄(IANP):生产用抗生素菌种。6)兽医微生物菌种保藏管理中心(CVCC) 农业部兽医药品监察所,北京。国外菌种保藏机构l)ATCC American Type Culture Collection. Rockvill. Maryland. U.S.A. 美国标准菌种收藏所,美国,马里兰洲,罗克维尔市。2) CSH Cold Spring Harbor Laboratory. U.S.A. 冷泉港研究室,美国。3) IAM Institute of Applied Microbiology. University of Tokyo, Japan. 日本东京大学应用微生物研究所,日本东京。4) IFO Institute for Fermentation. Osaka, Japan. 发酵研究所,日本大阪。5) KCC Kaken Chemical Company Ltd. Tokyo, Japan. 科研化学有限公司,日本东京。6) NCTC National Collection of Type Culture. London , United Kingdom. 国立标准菌种收藏所,英国伦敦。7) NIH National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, U.S.A. 国立卫生研究所,美国,马里兰洲,贝塞斯达。第一节微生物在自然界中的分布与菌种资源的开发第九章微生物的生态生态学(ecology):研究生命系统和和环境系统间相互作用规律的科学一些概念:生物圈(biosphere);生态系统(ecosystem);群落(community);种群(population);个体(individual);器官(organ);组织(tissue);细胞(cell); 细胞器(organelle);分子(molecule)。微生物生态:各种环境因素对微生物的作用及微生物对外界环境的反作用。微生物在自然界的分布:海陆空。
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个体小;营养类型多;存在休眠体。土壤中的微生物:为什么土壤是微生物的天然培养基?营养丰富;PH 适宜;温度、通气。分布情况:细菌,放线菌,霉菌,酵母菌。水体中的微生物:水中的病原微生物大肠菌群值=1000/大肠菌群数饮用水的标准:总细菌数:<100 个/ml;大肠菌群数:< 3 个/l。空气中的微生物:主要附着在灰尘上。如何检查空气中的微生物:平板检查法;将空气通入水中,检查水中的细菌;尘埃粒子计数器。空气中微生物的处理:空气过滤器;紫外线照射;喷雾消毒。工农业产品中的微生物:工业产品的霉腐;食品上的微生物;农产品上的微生物。极端环境下的微生物:嗜热微生物;嗜冷微生物;嗜酸微生物;嗜碱微生物;嗜盐微生物;嗜压微生物;抗辐射微生物。第二节微生物与生物环境间的关系互生共生寄生拮抗捕食互生(metabiosis):两种可单独生活的生物,当它们在一起时,通过各自的代谢活动而有利于对方,或偏利于一方的生活方式。“可分可合,合比分好” 互生的例子:固氮菌Vs 纤维素分解菌人Vs 肠道中的正常菌群排阻、抑制外来致病菌;产生有助于消化的淀粉酶、蛋白酶;分解有毒物质;营养物质。共生(symbiosis):两种生物共居在一起,相互分工合作,合二为一的极其紧密的一种相互关系。“相依为命,难分难解” 共生的例子:地衣(lichen):真菌与藻类; 根瘤菌与植物;反刍动物(牛)与瘤胃微生物。寄生(parasitism):一种小型生物生活在另一种较大生物体内或体表,从中夺取营养进行生长繁殖,并使后者蒙受损失甚至被杀死的一种相互关系。寄生物(parasite);寄主(host)。寄生的例子:噬菌体与宿主菌;烟草与TMV;人与病原微生物。拮抗(antagonism):某种生物产生的特定代谢产物可抑制其他生物的生长甚至杀死它们的一种相互关系。特异性拮抗;非特异性拮抗。拮抗的例子:青霉菌产生青霉素;乳酸菌产酸。捕食(predatism, predation):一种大型生物直接捕捉、吞食另一种小型生物以满足其营养需要的相互关系。捕食的例子:原生动物与细菌。第三节微生物与环境保护水体的污染——富营养化水体自净:天然水体受到污染后,在无人为处理的条件下,借水体自身的能力得到净化的过程。
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物理作用:稀释,沉降,扩散;化学作用:氧化,还原,分解,凝聚; 生物作用:细菌。富营养化(eutrophication):水华(water bloom),赤潮(red tide)。用微生物治理污水。污水分为生活污水和工业废水。评价水质的指标: 化学需氧量COD(chemical oxygen demand):用强氧化剂使一升污水中所含的有机物氧化所消耗的氧的毫克数。生化需氧量BOD(biochemical oxygen demand):微生物在有足够溶解氧存在的条件下,分解一升污水中所含有机物过程中所消耗的水中溶解氧的毫克数BOD5:20℃,5 天,1 升水溶解氧的减少量。生物的污水处理:完全混合曝气法;活性污泥法;生物膜法。活性污泥(activated sludge):由或细菌、原生动物和其他微生物群聚集在一起组成的凝絮团,在污水处理中具有很强的吸附、分解有机物或有毒物的能力。细菌是分解有机物的主力;细菌聚集成菌胶团,形成絮状物。细菌:吸附有机物,并分解之;吸附金属离子与有机物形成络合物;保护细菌;利于沉降; 原生动物:吞噬游离细菌;吞噬微小污泥;分泌粘性物质;利于絮凝; 霉菌:利于絮凝; 酵母菌:分解氰、酚。预处理:去掉一些大的颗粒、稀释污水;曝气:微生物分解有机物或有毒物;沉淀:出水、回流部分污泥。曝气的原理:是群体的协同作用。生物膜法(biofilm):生长在潮湿、通气的固体表面上的一层由多种活微生物构成的粘滑、暗色菌膜, 能氧化、分解污水中的有机物或某些有毒物。第一节传染第十章传染与免疫传染与传染病。传染(infection):病原微生物侵入机体后,在一定的部位生长、繁殖,从而引起一系列病理生理的过程。由于机体的抵抗力和病原菌两方面的力量不同以及环境因素的影响,有时不表现临床症状,成为隐性传染或带菌状态,有时表现出临床症状——传染病。传染病(infectious disease):可从一个宿主个体直接或间接传播到另一宿主个体的疾病。免疫:抗传染免疫(免疫防护):变态反应;自身稳定功能:自身免疫疾病;免疫监视作用:肿瘤病。
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决定传染结局的三大因素:病原体;宿主的免疫力;环境因素。病原体毒力(virulence),致病力(pathogenicity)。侵袭力(invastiveness):吸附和侵入能力;繁殖与扩散能力;抵抗宿主防御功能的能力。毒素(toxin) 外毒素(exotoxin):病原菌生长过程中不断向外界环境分泌的一类毒性蛋白。毒性强,抗原性强,毒性不稳定(对热和化学物质敏感);0.3-0.4%甲醛脱毒。内毒素(endotoxin):是G-菌细胞壁外层的组分之一,化学成分为脂多糖(LPS), 一般不分泌到环境中。毒性低,抗原性弱,化学稳定性强。热源物质(pyrogen)。入侵病原体的数量;侵入门径(entry point)。宿主的免疫力免疫力(immunity):免疫防御(immunologic defence);免疫稳定(immunologic homeostasis);免疫监视(immunologic serveillance)。环境因素:宿主环境(先天,后天);外界环境;自然环境;社会环境。传染的三种可能结局:隐性传染(inapparent infection);带菌状态(carrier state);显性传染(apparent infection)。
第二节非特异性免疫非特异性免疫(nonspecific immunity);先天免疫(innate immunity);自然免疫(natural immunity)。自然免疫:在生物长期进化过程中形成,属于先天即有、相对稳定、无特殊针对性的对付病原体的天然抵抗力。表皮和屏障结构(barrier structure):机械作用;化学保护作用;正常菌群的拮抗作用;粘膜表面的免疫球蛋白。皮肤与粘膜;血脑屏障(blood-brain barrier):内皮细胞层,细胞间连接紧密, 阻挡病原菌进入脑组织,保护中枢神经系统;血胎屏障(blood-embryo barrier): 母体子宫内膜和胎儿的绒毛膜,防止母体内的病原体进入胎儿。吞噬细胞的吞噬作用吞噬细胞:存在于血液、体液和组织中,能吞噬、杀死和消化病原菌的白细胞。多形核白细胞(polymorphonuclear leukocyte, PMN); 粒细胞(granulocyte):产生于骨髓,完全成熟后进入血流,是一类活动非常积极的重要细胞。急性炎症反应中的重要吞噬细胞。包括嗜中性粒细胞(neutrophil);嗜碱性粒细胞(basophil);嗜酸性粒细胞(eosinophil)。
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巨噬细胞(macrophage, M.):由骨髓干细胞分化而来,在组织中分布广;肝脏、肺、网状结缔组织。吞噬和杀菌作用抗原递呈作用:通过吞噬、处理和传递,对外来抗原物质进行加工,以适应激活淋巴细胞的需要;免疫调节作用:在外来抗原刺激下,产生多种可溶性生物活性物质,进行免疫调节;抗癌作用。炎症反应:炎症(inflammation):机体对病原体的侵入或其他损伤的一种保护反应,在相应部位出现红、肿、热、痛和功能障碍。是病理过程,也是免疫反应。正常体液或组织中的抗菌物质:补体(complement);干扰素(interferons, IFNs) 补体:是血清中的正常成分,有补充抗体作用的能力。有九种不同的成分C1,C2,C3,C4,C5,C6,C7,C8, C9;C1 包括C1q,C1r,C1s。被抗原抗体复合物激活后,可溶解和杀伤细胞,增强吞噬作用。动员大量吞噬细胞聚集在炎症部位; 血流的加速使血液中抗菌因子和抗体发生局部浓缩; 死亡的宿主细胞堆积可释放一部分抗菌物质; 炎症中心部位氧浓度下降和乳酸浓度提高,可抑制多种病原体的生长; 炎症部位体温的升高可降低某些病原体的繁殖速度。
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第三节特异性免疫特异性免疫(specific immunity) 获得性免疫(acquired immunity) 适应性免疫(adaptive immunity):机体针对某一种或一类微生物或其产物所产生的特异性抵抗力,是后天获得的。免疫应答(immune response):发生在活生物体内的特异性免疫的系列反应过程。是抗原、抗体的特异性反应。抗原( antigen, Ag ); 免疫原(immunogen):能刺激诱导机体发生免疫应答并能与相应抗体或T 淋巴细胞受体发生特异性免疫反应的大分子物质。免疫原性(immunogenicity); 抗原性(antigenicity)。免疫反应性(immunoreactivity); 反应原性(reactinogenicity)。半抗原(hapten);不完全抗原(incomplete antigen):只有反应原性,没有免疫性。完全抗原由两部分组成:载体(carrier):化学本质为蛋白质;半抗原。抗原的基本特性:具有一定化学组成和结构的大分子物质。异物性(foreignness):抗原的理化性质与其所刺激的机体的自身物质理化性质之间的差异程度特异性:由分子表面上特定化学基团所决定(抗原决定簇,antigenic determinant)。抗体(antibody):高等动物体在抗原物质的刺激下,由浆细胞产生的一类能与相应抗原在体内外发生特异性结合的免疫球蛋白。抗抗体(antiantibody):具有抗体功能的抗原刺激机体产生的相应的抗体。
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抗体的结构五类抗体:IgG,IgA,IgM,IgD,IgE。
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抗体形成的规律: 两次应答规律:初次免疫应答(primary immune response);再次免疫应答(secondary immune response)。回忆反应抗体出现的顺序:IgM 最早出现,IgA 最晚出现。影响抗体形成的因素: 抗原:是否按抗体形成的规律(亲缘关系,注射次数);机体:本身机体的差异。第四节免疫学方法及其应用抗原抗体反应的一般规律: 特异性:钥匙和锁;可逆性:Ag+Ab←→Ag·Ab; 定比性;阶段性:特异性结合阶段,可见反应阶段;条件依赖性影响抗原抗体间反应的因素: 电解质温度:温度上升,促进分子运动,增加抗原抗体的碰撞机会;但温度过高,抗原抗体解离、变性、破坏。一般最适温度为37 ℃ PH:蛋白质为两性电离性质,Ig 的等电点为PH=5~5.5。一般抗原抗体反应的PH 为6~8。抗原抗体间的主要反应: 凝集反应(agglutination) 直接凝集反应(direct agglutination):颗粒性抗原(完整细菌细胞或血细胞) 与相应的抗体在合适的条件下反应并出现肉眼可见的凝集团现象。凝集原(agglutinogen);凝集素(agglutinin);稀释抗体。
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定性:玻片法,已知抗体测未知抗原,如鉴定血型。
定量:试管法,已知抗原测未知抗体,诊断伤寒、肥达氏试验(Widal test)。间接凝集反应( indirect agglutination):需要载体,吸附可溶性抗原,成为人工的颗粒性抗原。测微量抗体,以增加测量的灵敏度。间接凝集抑制反应:将可溶性抗原与抗体混合,充分作用后再加入载体吸附相应的抗体。若此时抗体已被抗原中和,则不再发生凝集。用于检测抗原。如妊娠试验:孕妇尿中有绒毛膜促性腺激素HCG(抗原);尿+HCG 抗体; 再加入HCG 覆盖的红细胞。若尿中有HCG,HCG 与HCG 抗体接合,样品中无游离HCG 抗体。未出现沉淀,即发生凝集抑制,怀孕;出现沉淀,即未发生凝集抑制,未怀孕。
沉淀反应(precipitation):可溶性抗原与其相应的抗体在合适的条件下反应, 并出现肉眼可见的沉淀物。沉淀原(precipitonogen);沉淀素(precipitin);稀释抗原。环状沉淀反应(ring precipitation) 环状试验(ring test):用于抗原的定性;如鉴定血迹。絮状沉淀反应(flocculation precipitation):絮状反应,抗原与相应抗体在试管中或凹玻片上混匀,经过一段时间后,出现肉眼可见的絮状沉淀。如康氏试验(Kahn test)诊断梅毒。琼脂扩散法(agar diffusion) 免疫扩散法(immuno-diffusion)可溶性抗原与相应的抗体在半固体琼脂内扩散并进行沉淀反应。单向琼脂扩散( simple agar diffusion )定量测定抗原双相琼脂扩散( double agar diffusion )定性分析抗原或抗体对流免疫电泳(counter immuno-electrophoresis, CIE) 抗原和抗体分别置于凝胶板电场的正负极的小孔内,通电后抗原向正极移动而抗体向负极移动,在两孔间合适的抗原抗体浓度处会形成一条沉淀线。双相琼脂扩散与电泳技术的结合。 40 华东理工大学《微生物学教程》上课讲义火箭电泳法(rocket electrophoresis) 在已混有抗体的凝胶板上的小孔内加入抗原并进行电泳,在沿着电泳方向会形成火箭型沉淀线。已知标准抗原量可方便地测定未知标本中的抗原量。单相琼脂扩散与电泳技术的结合。双向免疫电泳(two dimentional immuno-electrophoresis) 免疫电泳与火箭点泳的结合。补体结合反应(complement fixation test) 有补体参与,并以绵羊红细胞和溶血素(红细胞的特异性抗体)是否发生溶血反应作指示的一种高灵敏度的抗原抗体的结合反应。2 个系统,5 种成分免疫荧光技术(immunofluorescens technique) 荧光抗体法(fluorescent antibody technique):抗体与荧光素结合形成荧光抗体。免疫酶技术( immunoenzymatic technique) 酶免疫测定法(enzyme immunoassay): 用酶作标记的抗体或抗抗体,进行抗原抗体反应的高灵敏度的免疫标记技术。
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放射免疫测定法(radioimmuno-assay):利用放射性同位素标记抗原或抗体。免疫反应的应用: 预防接种自动免疫和被动免疫的区别(见下表) 自动免疫被动免疫免疫产生较慢立即获得免疫体内可持续产生抗体抗体量不超过注射量再接受抗原增加反应无增加反应维持时间较长维持时间较短用于预防用于应急用于治疗:疫苗:类毒素(白喉类毒素、破伤风类毒素);免疫血清(抗毒素、丙种球蛋白);活疫苗:卡介苗,甲肝疫苗,脊髓灰质疫苗;死疫苗:百日咳,伤寒, 霍乱,乙脑,乙肝; 用于诊断;用于微生物分类。变态反应(allergy) 超敏反应(hypersensitivity):机体受同一抗原物质再次刺激后产生的一种异常的或病理性的,以组织损伤或生理功能紊乱为表现的免疫反应。变应原(allergen):完全抗原、半抗原完全抗原:异种血清蛋白,微生物,寄生虫,花粉,鱼,虾。半抗原:青霉素半抗原进入机体与组织结合成为完全抗原。变态反应的发生:变应原的剂量;进入体内的途径;机体免疫机能的状态。过敏反应:变应原与固定在细胞(肥大细胞)上的特异性抗体结合,使细胞释放过敏介质,从而引起效应器官生理功能紊乱。个体差异明显;反应快,消失也快;反应发生重;抗体为IgE。
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青霉素过敏反应: 青霉素分子(β-内酰胺环中的羧基)直接与人体内蛋白中的氨基结合,形成青霉噻唑蛋白。青霉素降解产物(青霉烯酸)与人体蛋白质结合。防治变态反应: 检出过敏原并避免接触; 脱敏治疗:小量多次注射某过敏原进行脱敏。例如:破伤风抗过敏药物;抗组胺药物:扑尔敏,息斯敏。
第一章绪论
第一节微生物学的研究对象与任务
研究对象--微生物:微生物(Microorganism,,microbe)是一切肉眼看不见或看不清的微小生物的总称。
微生物在生物界的地位:包括属于原核生物的细菌、放线菌、蓝细菌、;
属于真核生物的真菌(包括藻状菌纲、担子菌纲、子囊菌纲、半知菌纲);
以及属于非细胞结构的病毒。微生物学的任务:利用有利的一面为人类造福、变有害为有利。
微生物与人类的关系:疾病、物质的霉变、工农业生产、生态。
第二节微生物学的发展
第一阶段--推测期;
第二阶段--观察期;
第三阶段--生理期;
第四阶段--分子生物学时期。
1944 年,Avery 证明遗传的物质基础为DNA;
1953 年,Watson & Crick DNA 双螺旋结构;
1961 年,Jacob& Monod 操纵子学说;
1972 年,Berg Boyer & Cohen DNA 克隆技术;
1982 年,Prusiner 发现朊病毒;
1985 年Saiki PCR 技术(聚合酶链式反应);
1997 年,Wilmut 克隆羊20 世纪以核酸研究为核心:50 年代双螺旋结构;
60 年代操纵子学说;
70 年代DNA 重组;
80 年代PCR 技术;
90 年代DNA 测序。
人类基因组测序计划提前5 年完成,现由结构向功能转移(后基因组时代(post-genomics))。
从基因组到蛋白质组。
功能基因组学(functional genomics),蛋白质组学(proteome),生物信息学(Bioinformatics)。
模式生物:背景清楚、基因组小、便于测定和分析、可从中获取经验改进技术方法。
第三节我国微生物学的发展
古代对微生物学的认识与利用:酿酒,轮作,种痘。微生物学简况:见课本7-8 页。
第二章微生物形态与结构
Ⅰ原核微生物
第一节细菌细菌的形态和大小
形态:球状、杆状、螺旋状;
大小:以微米为度量单位。
细菌-原生质膜(plasma membrance)、原生质体(protoplast)、原生质。
细菌细胞的一般结构细胞壁(cell wall) 在细胞最外层、多孔性的、具有一定屏障作用,水和某些化学物质可以通过, 但对大分子物质有阻拦作用。功能:韧性、弹性。
化学组成:肽聚糖。1 G+菌G-菌核糖体(ribosome) 
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G+菌与G -菌的细胞壁结构 内壁层(2-3nm 肽聚糖层) 外壁层(8-10nm 脂多糖层) 细胞壁为一层(20~80nm 厚的肽聚糖层) 脂多糖:O-侧链(具有抗原性)———核心———脂质(内毒素的毒性中心) G+菌与G -菌的细胞壁组成与结构比较菌性质G+菌G- 肽聚糖含量少(10%) 多(40~90%) 直接连接通过五肽连接链连接方式氨基酸组成D-Glu-NH2 D-Glu DAP L-Lys 有无脂多糖有无脂蛋白无有垣酸细胞壁与革兰氏染色原生质体和球形体原生质体(protoplast):指在人为条件下,用溶菌酶除尽原有细胞壁或用青霉素抑制新生细胞壁的合成后,所留下的仅有一层细胞膜包裹着的圆球状渗透敏感细胞,一般由革兰氏阳性菌形成。脆弱,高渗溶液球形体:指还残留了部分细胞壁的原生质体,一般由革兰氏阴性菌所形成。细胞膜(cell membrane) 紧贴在细胞壁内侧的一层由磷脂和蛋白质组成的柔软、富有弹性的半透性薄膜。功能:主要为控制营养物质及代谢产物进出细胞。组成:磷脂蛋白质。结构:流动镶嵌模型。间体(mesosome) 拟线粒体细胞质(cytoplasm) 被细胞膜包围着的除核质体外的一切透明、胶状、颗粒状物质,可总称为细胞质。主要成分:核糖体、贮藏物、各种酶类、中间代谢物、无饥盐、载色体和质粒等,少数细菌还存在羧化体、伴孢晶体或气泡等构造。65%为核糖核酸,35%为蛋白质。是蛋白质合成的场所。原核生物70S,真核生物80S。2 贮藏物(reserve materials) 
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一类有不同化学成分累积而成的不溶性颗粒。在营养过剩时,聚合成各种贮藏颗粒,在营养缺乏时又被分解利用。气泡(gas vacuoles) 存在于许多光能营养型、无鞭毛运动水生细菌中的泡囊状内含物,内中充满气体。外由仅2nm 厚的蛋白质膜所包围,具有调节细胞比重,以使其漂浮在合适水层中的作用,借以获取光能、氧和营养物质。核质体(nuclear body) 又称拟核,指原核生物所持有的无核膜包裹、无固定形态的原是细胞核,是遗传的物质基础。质粒(plasemid) 核外基因(细胞质基因)。质粒的特性:1.环状双链小分子片段;2.决定细菌的某些遗传特性;3.独立自我复制,可转移,能携带一定的遗传信息;4.可自行消失。细菌细胞的特殊结构荚膜(capsule) 某些细菌细胞壁外存在的一层厚度不定的胶状物质。包括微荚膜(<200nm);荚膜(200nm);粘液层(无明显界面);菌胶团(几个菌共有的)。荚膜的主要成分:多糖。荚膜的功能:1.保护细菌(致病菌)免受白细胞的吞噬;2.菌体外的贮存物。有荚膜的菌大多为致病菌;有荚膜菌落为光滑型致病;无荚膜菌落为粗糙型不致病。通过负染色法可观察到鞭毛(flegellum)和菌毛(pilus , fimbria) 鞭毛:长在细菌的体表,着生在细胞膜上的长丝状、曲波的附属物。功能:为细菌的运动器官,运动的支点在细胞壁上。成分:为蛋白质。结构:鞭毛丝,鞭毛钩,基体。观察:显微镜,半固体穿刺。分类:单端鞭毛菌、端生丛毛菌、两端鞭毛菌、周毛菌。鞭毛的位置和数目具有细菌分类鉴定的意义。菌毛:性菌毛,普通菌毛。3 芽孢(endospore spore) 伴孢晶体(parasporal crystal;spore-companioned crystal)
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产芽孢的菌有两类:好气:Bacillus(枯草芽孢杆菌属);厌气:Clostridium(梭状芽孢杆菌属)。定义:某些细菌在其生长发育后期,可在细胞内形成的一个圆形或椭圆形、厚臂、含水量低、抗逆性强的休眠构造。芽孢形成过程①束状染色质形成;②细胞膜内陷,细胞发生不对称分裂,其中小体积部分即为前芽孢(forespore);③前芽孢的双层隔壁形成,这时抗辐射性提高;④在上述两层隔壁间充填芽孢肽聚糖后,合成DPA,累积钙离子,开始形成皮层,折光率增高;⑤芽孢衣合成结束;⑥皮层合成完成,芽孢成熟,抗热性出现;⑦芽孢囊裂解,芽孢游离。特性:含水量低,耐热,含DPA-Ca。几种位置和形状: 如何观察: 在形成芽孢的同时,在芽孢旁形成的一颗菱形、方形或不规则形的碱溶性蛋白质晶体。为有毒蛋白质,一般一个细菌产生一个,作为生物农药。例:苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis) 细菌的群体形态菌落(colony):将单个细菌(或其他微生物)或一小堆同种细胞接种在固体培养基的表面(有时为内层),当它占有一定的发展空间并给予适宜的培养条件时,该细胞就会迅速生长繁殖并形成细胞堆,此即菌落。菌落就是在固体培养基上(内)以母细胞为中心的一堆肉眼可见的、有一定形态、构造等特征的子细胞集团。菌落特征:一般呈现湿润、较光滑、较透明、较粘稠、易挑取、质地均匀、以及菌落正反面或边缘与中央部位的颜色一致等。单菌落表面特征群体效应细菌的繁殖无性繁殖:不经过两性细胞的结合,只是营养细胞的分裂或营养菌丝分化而形成同种新个体的过程。裂殖(横分裂法):同型,异型。繁殖的过程:细胞核和细胞质的分裂;横隔壁的形成;子细胞的分离。
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立克次氏体(Rickettsia) 处于细菌和病毒之间,但更接近细菌。G-菌特点:具有细胞壁,不能通过细菌滤器;专性细胞内寄生,不能在人工培养基上培养。支原体(Mycoplasma) 介于细菌和立克次氏体之间,是原核生物中最小的,具有致病性。50-60 年代称为PPLO 特点:无细胞壁,可通过细菌滤器;能在人工培养基但条件苛刻(需补充血清);菌落形态似荷包蛋。衣原体(Chlamydia) 介于立克次氏体和病毒之间。以前将衣原体归于病毒,沙眼衣原体特点:具有细胞壁,但能通过细菌滤器,专性细胞内寄生(能量寄生)。支原体、立克次氏体、衣原体和病毒的比较比较项目细胞构造含核酸类型DNA和RNA DNA 和RNA DNA 和RNA DNA 和RNA 核糖体细胞壁细胞膜繁殖时个体完整性大分子合成能力产ATP 系统氧化谷氨酰胺能力对抑制细菌抗生素的反应病毒衣原体立克次氏体支原体无有有有无有有有有(含肽聚糖) 有(不含肽聚糖) 无无有(无甾醇) 有(含甾醇) 无有(无甾醇) 不保持保持保持保持无无有有无无有有无无有有敏感(对抑制细胞有抗性敏感壁合成者例外) 敏感(青霉素例外)
第三章微生物的形态与构造
Ⅱ真核微生物
原核生物与真核生物的比较原核生物即广义的细菌,指一大类细胞核无核膜包裹,只存在称作核区(nuclear region)的裸露DNA 的原始单细胞生物,包括真细菌(eubacteria)和古生菌(archaea)两大类群。其中除少数属古生菌外,多数的原核生物都是真细菌。真核生物是一大类细胞核具有核膜,能进行有丝分裂,细胞质中存在线粒体或同时存在叶绿体等多种细胞器的生物。真菌、显微藻类和原生动物等是属于真核生物类的微生物,故称为真核微生物(eukaryotic micro-organisms)。第一节酵母菌(yeast) 存在的地方:含糖量较高的偏酸性环境(如果园), 利用烃类的酵母菌可在油田或煤油厂附近分离到。用途:理论研究;工业生产:食品工业(馒头发酵酿酒), 制药业(提取核苷酸),作为菌体蛋白;有害的酵母菌:白色念珠菌(口腔溃疡),表皮癣菌属(足癣) 细胞的形态构造:形态:卵圆形,假丝状。大小:比细菌大约十倍
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构造: 细胞壁: 葡聚糖(glucan), 甘露聚糖(mannan);细胞膜:甾醇;细胞核:真核(如涂片好能看到的黑点即为细胞核)。繁殖方式: 无性繁殖:芽殖(主要方式),芽裂(产生横隔壁, 较少见),裂殖(二分分裂)。有性繁殖:形成子囊孢子进行有性繁殖,过程: 质配→ 核配→减数分裂(核配形成的双倍体可单独存在,因为双倍体的酵母菌生活力强,所以工业生产上的酵母菌一般为二倍体。) 减数分裂包括二次细胞分裂和一次核分裂。在减数分裂过程中可发生基因重组。菌落特征:易挑起,乳白色,湿润,粘稠,比细菌的菌落大而且厚,酒香味。第二节丝状真菌——霉菌(mold) 营养来源:主要为糖类和少量氮、矿物盐类,极易在含糖的食品(饼干、面堡、各种谷物和水果)上生长。用途:工业上;理论研究。有害的霉菌:食品的霉变等。霉菌的形态结构:与放线菌一样为丝状菌,但菌丝比放线菌粗约10 倍。有单细胞和多细胞之分。菌丝也有三种:基内菌丝,气生菌丝,孢子丝。细胞壁成分:几丁质(为多糖,由N-乙酰葡糖胺通过β-1,4 糖苷键相连而成)。细胞膜:甾醇。霉菌的特征性菌丝: 根霉(假根) 毛霉() 青霉(青霉穗)曲霉(足细胞) 菌落特征:不易挑起,菌落疏松,产色素。繁殖方式:无性繁殖:通过无性孢子繁殖; 有性繁殖:也是三个阶段。第四章微生物的形态和构造Ⅲ非细胞型生物第一节病毒(virion) 病毒的特性:个体极小,只能在电子显微镜下观察到,能通过细菌过滤器;专性活细胞内寄生;无细胞结构。病毒是超显微的、无细胞结构的、专性活细胞内寄生的实体。病毒的两重性:活细胞外具一般化学大分子特征,活细胞内具生命特征。
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病毒的形态构造和化学组成病毒的大小:以纳米为单位。病毒的形态:动物病毒:圆形(球形);植物病毒: 杆形;微生物病毒(噬菌体):蝌蚪形。病毒的化学组成:蛋白质(外壳),DNA 或RNA。病毒的结构: 衣壳粒(capsomere) →衣壳(capsid) (蛋白质外壳); 衣壳+核髓(core) (DNA 或RNA)→核衣壳蛋白质外壳的作用:构成病毒粒子外壳,起保护病毒核酸的作用。核髓的作用:贮存病毒的遗传信息,控制病毒的遗传变异、增殖及对宿主的感染性。动物病毒:线状双链DNA 或单链RNA;植物病毒:线状RNA;噬菌体:线状双链DNA。病毒的群体形态包涵体(inclusion body):某些病毒寄生在宿主中会产生在光学显微镜下可见的小体,是病毒或尚未装配的病毒亚基的聚集体,属蛋白质性质,是有毒蛋白,作为生物农药。优点:专一性高;毒性强;使用方便;对人、畜安全;保护环境。噬菌斑(plaque):在菌苔上逐步形成的噬菌体群体,由于其侵蚀宿主细胞的结果,会使菌苔上出现—个个具有一定形状、大小、边缘和透明度的噬菌斑。(nucleocapsid) 第二节病毒的繁殖噬菌体(bacteriophage)的繁殖吸附(adsorption):吸附是特异性的,即在受体细胞上有吸附位点,这样的吸附不仅宿主细胞表面和噬菌体之间形成牢固的化学结合,而且病毒粒子本身在结构上也发生了变化。当宿主细胞发生突变后,就不能被噬菌体吸附. 抗噬菌体菌株。宿主细胞:有吸附点;有调节机制:可以修复细胞壁的微小损伤;修复能力是有限的:一旦被噬菌体大量吸附,细胞就裂解而噬菌体没有增殖(自外裂解) 侵入(pentration) 尾部的酶水解肽聚糖,使细胞壁产生一小孔,注入核酸,而蛋白质外壳则留在细胞的外面。尾鞘可以明显提高噬菌体核酸的注入速率增殖(replication) 核酸的复制;蛋白质的生物合成;噬菌体DNA 一旦进入细胞中,细胞的活动受噬菌体DNA 的支配,细胞核自动裂解成碎片,根据噬菌体的基因复制噬菌体的核酸、蛋白质等外壳成熟(maturity)或装配裂解(lysis)或释放(release) 在固体培养基表面可见噬菌斑;在液体培养基中可见培养物被溶解,培养基变清。8 溶原性细菌(lysogen; lysogenic bacteria)
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噬菌斑及噬菌体效价(titre):在这里,效价表示每毫升试样中所含有的具侵染性的噬菌体粒子数,又称为噬菌斑形成单位数。一步生长曲线(one-step growth curve) 潜伏期(latent phase),裂解期(rise phase),平稳期(burst size)。当温和噬菌体侵入宿主细菌细胞后,噬菌体DNA 复制,但不合成蛋白质,宿主细胞也不裂解,继续进行正常的分裂繁殖,即在核染色体上整合有前噬菌体并正常生长。在偶尔情况下,某一代发生裂解时放出新的子代噬菌体,故具有潜在释放成熟时菌体的能力。溶原性细菌的特征:稳定遗传,自发裂解,诱发裂解,免疫性。溶原性细菌的复愈:溶源转变。溶原性(lysogeny) 烈性噬菌体(lytic phage); 温和噬菌体(temperate phage)。噬菌体DNA 侵入宿主细胞后,噬菌体DNA 随宿主细胞DNA 复制,噬菌体蛋白质不能合成,宿主细胞也不裂解,继续进行正常的分裂繁殖。原(前)噬菌体(prophage): 第二节亚病毒(subvirus) 类病毒(viroid) 1971 年首次报道;现已鉴定的有20 多种。分子结构:含246~375 个核苷酸的单链环状RNA 分子,没有蛋白质外壳。专性活细胞内寄生。例:马铃薯纺锤形块茎类病毒(PSTV);鳄梨白斑类病毒。卫星RNA(satellite RNA) 依赖辅助病毒(helper virus) 进行复制的小分子单链RNA 片段(拟病毒) 特性:必须依赖辅助病毒才能进行侵染和复制,可干扰辅助病毒的复制。卫星病毒:必须依赖辅助病毒才能复制。9 例:卫星烟草花叶病毒STMV(Satellite tobacco moscire virus)。
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丁型肝炎病毒(Hepatitis delta virus,HDV)δ肝炎病毒;辅助病毒:乙型肝炎病毒。朊病毒(prion) 是蛋白质侵染因子(protein infection);为疏水蛋白质。1982 年美国斯坦利.普鲁西内尔(S.B. Prusiner)提出;于1997 年获诺贝尔生理学与医学奖。朊病毒病:库鲁病(Kuru);克-雅氏病(CJD,Creutzfeldt-Jakob disease);GSS 综合症( Gerstmann-Straussler-Scheinker);致死性家族失眠症(FFI,fatal familial insomnia)。潜伏期长人的朊病毒病三种形式:传染型,遗传型,散发型。第三节病毒与实践噬菌体与发酵工业噬菌体的分离培养:分离;纯化;制备;噬菌斑及效价测定。噬菌体的防治: 污染的原因:生产菌株本身;环境及发酵罐本身;空气过滤器;环境;操作人员。防治:识别:正确的判断,普及知识;消灭污染源:罐及管道的死角,控制活菌体的排放(摇瓶,排气),净化环境,筛选抗噬菌体菌株。病毒与人类的疾病干扰素1957 年发现,为糖蛋白,由大多数脊椎动物对病毒感染应答产生, 天然的抗病毒物质。干扰素诱导剂作用于活细胞后,由活细胞产生的一种蛋白质,当它再作用于其它细胞时,该细胞即可获得抗病毒和抗肿瘤等方面的免疫力干扰素的作用机制蛋白质和病毒核酸结合. 抑制病毒的反转录干扰素的种类α- 干扰素:白细胞干扰素β- 干扰素:成纤维细胞干扰素γ- 干扰素:免疫干扰素(是由淋巴细胞接受抗原刺激而产生的)。天然产生的很少, 一般是由基因工程菌产生的人类的病毒病一般的病毒病:天花;小儿麻痹症(脊髓灰质疫苗);肝炎(乙肝疫苗、甲肝疫苗);脑膜炎。理想的药物不多,一般注射疫苗加以预防。肿瘤:1911 年,病毒可以使鸡致癌。现在认为人体存在癌基因,癌基因有防癌的作用,但当它发生细胞突变时,其结构发生变化, 失去抑制细胞生长的能力,从而导致癌变。艾滋病(Aids):全称为人类获得性免疫缺陷综合症(Acquired Immune Dificiency Syndrome), 由人体免疫缺损病毒(HIV)引起。1987 年定名。
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HIV 病毒为球形。有两种:HIV-1 危害人体(9 型,A B C D E F G H O)。致病原理: 正常的免疫系统:抗原传递给T 细胞.B 细胞.产生抗体。HIV 病毒与T 细胞相似,从而破坏了正常的免疫系统,由于没有了抗体,故表现出抵抗力差。原先寄生于中非猴类上的小小病毒1981 年首先在中美洲发现1983 年从病原体上分离到了该病毒1987 年定名为HIV 治疗:疫苗:灭活疫苗,重组疫苗。药物:AZT(叠氮脱氧胸腺嘧啶核苷)。传播途径:不正常性行为,血液,注射器,母婴传给幼儿。防止策略:抑制病毒HIV 的增殖,增强机体的免疫力,杜绝传播途径。病毒在基因工程中的应用只有一半左右的基因参与其生命活动,因此可插入分子量较大的DNA 片段。λ噬菌体:科斯质粒(cosmid): λ噬菌体的粘性末端和质粒构建而成。特点:感染力强;cos 位点连接形成环状,似质粒;可克隆大片段。用途:理论研究;包涵体:昆虫病毒的多角体用于生物防治;吞噬绿脓杆菌。危害:工业发酵的污染;人类的疾病。光能碳源\能源光能异养型有机物光能自养型无机物第五章微生物的营养和培养基营养(nutrition):生物体从外部环境中摄取对其生命活动必须的能量和物质,以满足正常生长和繁殖需要的一种最基本的生理功能。营养物(nutrient):具有营养功能的物质。第一节微生物的六种营养要素细胞的化学组成:元素:C、H、O、N、矿物元素;存在形式:有机物、无机物。微生物是杂食性的:一般生物能利用的,微生物能利用;一般生物不能利用的,微生物也能利用;一般生物有害的,微生物还能利用。微生物的营养要素:碳源、氮源、能源、生长因子、无机盐、水。碳源(carbon source):有机碳源:淀粉、葡萄糖等;无机碳源:Na2CO3 等。葡萄糖、乳糖的二次生长。氮源(nitrogen source):有机氮源:蛋白胨、黄豆粉、玉米浆;无机氮源:NH4NO3、(NH4)2SO4; 速效氮源,迟效氮源。能源(energy source):化学物质,辐射能。生长因子(growth factor):有三类:氨基酸,维生素,核苷酸。无机盐:提供矿物元素和微量元素。水:水是良好的溶剂;生化反应在水中进行;水的比热大。第二节微生物的营养类型划分依据:碳源和能源。化学能化能异养型化能自养型
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单纯扩散(simple diffusion) 氧、二氧化碳、乙醇、某些氨基酸等小分子; 亲脂性分子从高浓度到低浓度的扩散来运输它利用细胞膜的通透性,细胞膜是一道屏障。又称被动运输(passive transport)
促进扩散(facilitated diffusion) 需要特异性载体蛋白(carrier protein),即渗透酶(大多为诱导酶)。每种载体蛋白运输相应的物质。从高浓度到低浓度。原理:利用膜内、膜外被运输物质和载体蛋白的亲和力的不同。
第三节营养物质进入细胞的方式营养物质的吸收与代谢产物的分泌,涉及到物质的运输,而关键是细胞膜。运输:不耗能运输(单纯扩散,促进扩散);耗能运输(主动运送,基因移位)。主动运送(active transport) 是微生物吸收营养的主要方式。需要特异性载体蛋白需要能量来改变载体蛋白的构象。是逆浓度梯度的运输。基团移位(group translocation) 在运输过程中,物质分子发生了化学变化。每输入一个葡萄糖分子,就要消耗一个ATP 的能量。 
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第四节培养基培养基(medium,culture medium):是一种人工配制的、适合微生物生长繁殖或产生代谢产物用的混合养料。选用和设计培养基的原则和方法四个原则:目的明确(根据不同微生物的营养需要配制不同的培养基);营养协调(注意营养物的浓度和配比,特别是碳氮比( C/N ));物理化学条件适宜(PH、渗透压、水活度); 经济节约。四种方法:生态模拟,查阅文献,精心设计,试验比较。培养基的种类及其应用按对培养基的了解来分天然培养基(complex medium, undefined medium),较经济,一般用于大规模生产组合培养基(defined medium)或称合成培养基(synthetic medium),较昂贵,一般用于研究工作(代谢、遗传分析),特点:组份精确,重复性好。按培养基外观的物理状态来分固体培养基(solid medium),一般加有凝固剂,凝固剂含量一般为1~2% 作为凝固剂的条件:不被微生物分解利用,生长温度范围内保持固体状态,凝固点温度对微生物无害,不因灭菌而破坏,透明度好、配制方便、价格低。用途:由于固体培养基能提供表面,形成单菌落,因此可用于:菌种分离、鉴定、保藏等半固体培养基(semi-solid medium),凝固剂含量一般约为0.5% 用途:观察细菌的运动,测定噬菌体效价等。液体培养基(liquid medium),培养基中没有凝固剂。用途:大量培养微生物,研究生理代谢等。按培养基的功能来分选择培养基(selected medium) 用途:将混合军中所需的目的微生物分离出来加富培养基(enriched medium) 鉴别培养基(differential medium) 用途:细菌学检验遗传研究第六章微生物的代谢和发酵新陈代谢(metabolism)简称代谢,是指发生在活细胞中的各种分解代谢(catabolism)和合成代谢(anabolism)的总和。即新陈代谢=分解代谢+台成代谢分解代谢又称异化作用,是指复杂的有机物分子通过分解代谢酶系的催化产生简单分子、能量(一般以腺苷三磷酸即ATP 形式存在)和还原力(或称还原当量,一般用[H]来表示)的作用。合成代谢又称同化作用,与分解代谢正好相反,是指在合成代谢酶系的催化下,由简单小分子、ATP 形式的能13 初级代谢: 次级代谢: 第一节微生物的能量代谢华东理工大学《微生物学教程》上课讲义量和[H]形式的还原力一起,共同合成复杂的生物大分子的过程。最初的能源(primary energy sources): 有机物,还原态无机物,日光辐射能。通用能源(universal energy source): ATP。生物氧化:脱氢、递氢、受氢。发酵:基质为有机物,最终电子受体为有机物。葡萄糖→ 丙酮酸(EMP 途径) 产生2 个ATP( 底物水平磷酸化) 由于基质氧化不彻底,发酵的结果仍积累有机物,所以产生的能量较少。例:葡萄糖→ 丙酮酸→乳酸,产生54 kcal 的能量不同的微生物发酵可产生不同的产物,例:葡萄糖→ 丙酮酸→乳酸or 乙醇or 丙酮丁醇有氧呼吸:彻底的氧化过程。基质为有机物,最终电子受体为分子氧。葡萄糖→CO 产生38 个ATP,其中底物水平磷酸化产生2 个ATP,氧化磷酸化产生36 个ATP EMP 途迳:葡萄糖→丙酮酸;丙酮酸→乙酰CoA(氧化脱羧体系);TCA 循环。电子传递链无氧呼吸: 基质为有机物,最终电子受体为无机物。C6H12O6+12KNO3→6CO2+12KNO2+6H2O + 429kcal 三种生物氧化方式的产能水平比较2 + H2O 
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最高:有氧呼吸,第二:无氧呼吸, 最低:发酵。“鬼火”的生物学解释: 在无氧条件下,某些微生物在没有氧、氮或硫作为呼吸作用的最终电子受体时,可以磷酸盐代替,其结果是生成磷化氢(PH3),一种易燃气体。当有机物腐败变质时,经常会发生这种情况。若埋葬尸体的坟墓封口不严时.这种气体就很易逸出。农村的墓地通常位于山坡上,埋葬着大量尸体。在夜晚, 气体燃烧会发出绿幽幽的光,长期以来人们无法正确地解释这种现象,将其称之为“鬼火”。烃类化合物的分解烃类化合物主要是被氧化,是一个绝对需氧的过程,在缺氧条件下,烃类完全不受微生物影响。(所以地下沉积的石油会长期不变) 能分解烃类的微生物:细菌(假单胞菌,分枝杆菌,棒状杆菌);放线菌(链霉菌,诺卡氏菌);酵母菌。一般在油田及炼油厂附近都能分离到。应用:萘被假单胞菌利用生成水杨酸;丙烯氰生成丙烯酰胺;石油脱蜡;石油代替粮食发酵; 石油探测。绝对好氧:优点:石油不被破坏;缺点:发酵过程需通入大量氧气,消耗动力;发酵培养基中需要加乳化剂(因为烃类石油类物质,与水不相容)。第二节生物固氮固氮生物:能使氮分子还原成氨的生物。一般均为原核生物,于1888 年分离到。能固氮的微生物:自生固氮菌,共生固氮菌,联合固氮菌。固氮的生化机制:固氮反应的必要条件:固氮酶(nitrogenase),能量(ATP),还原力,严格的厌氧微环境。固氮的生化途径:N2+8[H]+18~24ATP→2NH3+H2+18~24ADP+18~24Pi 
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第七章微生物的生长及其控制生长(growth):个体体积或重量的变化;繁殖(reproduction):个体数量的变化。个体生长→个体繁殖→群体生长;群体生长=个体生长+个体繁殖。生长和繁殖是交替进行的。衡量群体生长的量:重量、体积、密度、浓度、个体数目等。第一节测定生长繁殖的方法纯培养的分离法自然界中的微生物都是杂居在一起的,每种微生物的生长情况是不同的。纯种分离:稀释到平皿法;平板划线分离法; 单细胞挑取法;利用选择培养基分离法。微生物生长的测定测定生长量:测体积;称干重;比浊法;生理指标法(测含氮量;测含碳量;测磷、DNA、RNA、ATP。) 测细胞的个数:比例计数法、血球计数法、平板活菌计数法。
第二节微生物的生长规律细菌的个体生长和同步生长。研究细菌个体的生长方法:用电子显微镜观察细胞的超薄切片; 同步培养(synchronous culture):使群体中的所有个体细胞尽可能的处于同样细胞生长和分裂期中。同步生长(synchronous growth):通过同步培养使细胞群体处于分裂步调一致的状态。获得同步生长的方法:选择法,诱导法。典型生长曲线(growth curve) 四个阶段: 延滞期、指数期、稳定期、衰亡期。16 华东理工大学《微生物学教程》上课讲义生长速率常数(growth rate constant):每小时分裂的代数R。延滞期(lag phase) 特点:生长速率常数为零,代谢活跃,对外界不良环境敏感,细胞变大,RNA(特别是rRNA) 含量增高。如何缩短延滞期:种龄,接种量,培养基成分。指数期(exponential phase) 特点:生长速率常数最大,代时(generation time)最短,细胞平衡生长,酶系活跃,代谢旺盛。作为发酵生产的良好种子,可缩短延滞期。稳定期(stationary phase) 特点:生长速率常数为零,菌体产量达最高点,菌体产量与营养物消耗有一定的比例关系。稳定期到来的原因:营养物耗尽,营养物比例失调,积累了有害代谢产物,理化条件不适宜。如何延长稳定期:补料(增加养料,调节PH)。细胞开始贮存糖原、异染颗粒和脂肪等贮藏物,芽孢杆菌开始形成芽孢,积累次级代谢产物。初生代谢物(primary metabolites),次生代谢物(secondary metabolites),稳定期产物(idiolites),菌体生长期(trophophase),代谢产物合成期(idiophase)。衰亡期(decline phase;death phase) 特点:负生长,菌体自溶。如何利用生长曲线指导生产?种龄:利用对数生长期的种子;延长稳定期;确定放罐时间。微生物的连续培养:单(分)批培养(batch culture), 密闭培养(closed culture),连续培养(continuous culture),开放培养(open culture)。恒浊器(turbidostat) 改变培养基的流速,以控制菌的浓度恒定。微生物在恒浊器中始终以最高的生长速率进行生长。用于获得大量菌体、与菌体生长相平行的代谢产物的生产。恒化器(chemostat;bactogen) 培养基的流速恒定,以某一营养物为生长限制因子。用于与生长速率相关的理论研究。单级连续培养器(one-step continuous fermentor): 代谢产物的生产速率与菌体生长速率平行。多级连续培养器(multi-step continuous fermentor): 代谢产物的生产速率与菌体生长速率不平行。连续发酵(continuous fermentation) 连续培养用于生产实践时,就称为连续发酵连续培养的优缺点优点:高效,便于自动控制,产品质量稳定。缺点:菌种易退化,易污染杂菌,培养基利用率低。高密度培养(high cell-density culture) 基因工程菌提高产物的比生长率:单位时间单位体积内的产物量。提高分离提取的效率(下游工程down-stream processing)。关键问题:补料,提高溶解氧浓度。
17 第三节影响微生物生长的主要因素温度从两个方面来看: 温度上升,反应速率加快,生长速率加快;温度上升,蛋白质、核酸被破坏。微生物的生长有一个温度范围,在这个范围内有一个生长的最适温度、最低温度和最高温度。最适温度:菌代时最短,生长速率最高。氧气专性好氧菌(strict aerobe) , 兼性厌氧菌(facultative aerobe) , 微好氧菌(microaerophilic bacteria),耐氧菌(aerotolerant anaerobe),厌氧菌(anacerobe)。好氧生物因为有SOD,因此剧毒的超氧阴离子自由基(O2·- ) 被歧化成毒性稍低的H2O2 , 在过氧化氢酶的作用下,H2O2 再变成无毒的H2O。PH 最适PH,最低PH,最高PH。PH 的影响:影响营养物的离子化程度,影响环境中有毒物质对微生物的粗性,影响代谢反应中各种酶的活性。 华东理工大学《微生物学教程》上课讲义物理杀菌因素的代表——温度利用高温杀菌:干热灭菌(焚烧灭菌,灼烧灭菌);湿热灭菌(煮沸消毒法,高压蒸汽灭菌法,间歇灭菌法,巴斯德消毒法) 化学杀菌剂或抑菌剂表面消毒剂(重金属盐类:红汞; 有机化合物:酚类、醇类、酸类、醛类;氧化剂:卤素及其化合物; 表面活性剂:新洁尔灭,肥皂;染料:龙胆紫;气体:环氧乙烷)。抗代谢药物的代表——磺胺类药物第四节有害微生物的控制灭菌(sterilization):采用强烈的理化因素使任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施,称为灭菌。消毒(disinfection):采用较温和的理化因素,仅杀死物体表面或内部一部分对人体或动植物有害的病原菌,而对被消毒的对象基本无害的措施。防腐(antisepsis):利用某种理化因素完全抑制霉腐微生物的生长繁殖,即通过制菌作用(becteriostasis)防止食品、生物制品等对象发生霉腐的措施。化疗(chemotherapy):利用具有高度选择毒力(selective toxicity)即对病原菌具高度选择毒力而对其宿主基本无毒的化学物质来抑制宿主体内病原微生物的生长繁殖,借以达到治疗该宿主传染病的一种措施。抗代谢药物一类在化学结构上与细胞内必要代谢物的结构相似,并可干扰其正常代谢活动的化学物质。SMZ:磺胺二甲恶唑(sulfamethoxazole)
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抗生素抑制细胞壁的形成-青霉素(青霉素不能口服,它不耐酸,在胃中被降解); 影响细胞膜的功能-多粘菌素; 干扰蛋白质合成-链霉素; 阻碍核酸的合成-博莱霉素。微生物的抗药性。微生物对环境的适应性产生钝化酶;改变细胞膜的透性;细胞内被药物作用的部位发生改变。利用抗药性来指导生产例:如何利用抗磺胺类药物的菌株生产对氨基苯甲酸? 磺胺对氨基苯甲酸如果对氨基苯甲酸增加,磺胺药疗效降低,所以寻找抗磺胺药的菌株就可增加对氨基苯甲酸的产量。第八章微生物的遗传变异和育种遗传性:亲代具有把他所有的形状给子代的特性。变异性:子代具有改变亲代遗传性状的特征。遗传型(genotype),表型(phenotype),变异(varition),饰变(modification)。
第一节遗传变异的物质基础三个经典实验: 转化试验:1928 年,F. Griffith,肺炎双球菌, Streptococcus pneumoniae。1944 年,O.T.Avery DNA RNA 蛋白质多糖DNA+DNA 酶RⅡ RⅡ RⅡ RⅡ RⅡ 少量SⅢ - - - ___ 噬菌体感染试验:1952 年,A. D. Hershey(侯喜) M. Chase(蔡斯) 病毒的重建试验: 1956 年,H. Fraenkel-Conrat (弗朗克-康勒脱) 噬菌体感染试验和病毒的重建试验的说明图见下页
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朊病毒的发现和思考:蛋白质是否是遗传的物质基础?prpsc,蛋白质折叠。DNA 的结构基本单位是核苷酸:核糖(戊糖)+碱基+磷酸。碱基有四种:腺嘌呤(A),鸟嘌呤(G),胸腺嘧啶(T), 胞嘧啶(C)。单链上的碱基不受配对的限制,决定了遗传的多样性。半保留的自我复制保证了生物遗传的相对稳定。第二节基因突变和诱变育种20 基因突变(gene mutation):突变细胞的遗传物质的分子结构或数量发生可遗传的变化。突变的类型: 营养缺陷型(auxotroph)菌株:野生型菌株发生基因突变而丧失合成一种或几种生长因子的能力,从而不能在基本培养基上生长的变异菌株。抗性突变型(resistant mutant)菌株:野生型菌株发生基因突变而对某化学药物或致死物理因子产生抗性的菌株。
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条件致死突变型(conditional lethal mutant)菌株:菌株发生基因突变后,在某种条件下可正常生长,而在另一种条件下无法生长。形态突变型(morphological mutant)菌株:菌株发生基因突变,而在个体形态或菌落形态上发生突变的菌株。抗原突变型(antigenic mutant)菌株:菌株发生基因突变,而在细胞抗原结构上发生变异的菌株。产量突变型(metabolite quantitative mutant)菌株:菌株发生基因突变,在代谢产物产量上明显有别于原始菌株的突变株。正变株(plus-mutant);负变株(minus-mutant)。突变率(mutation rate):一个细胞每一世代某一性状突变的几率;群体中每一世代(分裂一次)产生突变的个数。突变率:10-8 基因突变的特点: 不对应性:突变的性状与引起突变的原因之间没有直接的对应关系; 自发性(10-6~10-9);稀有性;独立性;可诱变性;稳定性; 可逆性:回复突变(reverse(back)mutation)。证明基因突变自发性和不对应性的实验: 变量试验(fluctuation test):波动试验、彷徨试验;1943 年;S. E. Luria& M. Delbruck。涂布试验:1949 年,H.B.Newcombe 影印平板培养法(replica plating):1952 年,J. Lederberg 微生物产生抗药性的途径: 基因突变而产生抗药性; 抗药性质粒的获得(R 因子); 生理上的适应。基因突变及其机制: 右图为突变的类型。
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诱变(induced mutation): 碱基的置换(substitution),转换(transition),颠换(transversion)。两个例子:亚硝酸;5-溴尿嘧啶(碱基类似物base analog)。移码突变(frame-shift mutation phase-shift mutation) 
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染色体畸变(chromosomal aberration) 转座(transposition):DNA 序列通过非同源重组的方式,从染色体某一部位转移到同一染色体的另一部位或其它染色体上的某一部位。转座因子(transposable element):具有转座作用插入序列(insertion sequence,IS);转座子(transposon,Tn); 转座噬菌体(transposable phage) 自发突变(spontaneous mutation):由微生物自身有害代谢产物引起;由DNA 复制过程中碱基配对错误引起;由背景辐射和环境因素引起。遗传密码改变的表型效应: 
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紫外线对DNA 的损伤及其修复紫外线(ultraviolet ray)对DNA 的损伤;嘧啶二聚体; 光复活作用(photo reactivation,photo restoration) 切除修复(excision repair) 突变与育种自发突变与育种( Breeding by spontaneous mutation) 从生产中育种;定向培育优良菌株。自然选育的目的:维持原有的产物的合成水平(稳产);诱变后的菌株群体中表现出各种生理特性需要纯化。诱变育种(breeding by induced mutation) 诱变育种的几个方向:提高产量;改进产品质量;产生新的生物活性物质诱变育种的基本环节(左图所示) 出发菌株→诱变→初筛→复筛→放大→获得优良变异株。诱变育种两个主要的环节:诱变(induced mutation);筛选(screening)。诱变育种中的几个原则: 诱变剂的选择:简便有效; 诱变剂的种类:物理诱变剂,化学诱变剂,拟辐射物质(radiomemetic chemical); 诱变剂量的选择:存活率或死亡率曲线,剂量-诱变率曲线; 出发菌株(original strain)的选择:处理细胞所处的状态,一般为单孢子悬液; 表型延迟(phenotype lag):遗传型虽已突变,但表型却要经染色体复制、分离和细胞的分裂后才表现出来。利用复合处理的协同效应(synergism);利用和创造形态、生理和产量之间的相关指标;设计高效的筛选方法:推理选育。突变株的筛选:产量突变株的筛选,抗药性突变株的筛选,营养缺陷型菌株的筛选
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营养缺陷型突变株:野生型菌株(wide type strain);原养型(prototroph); 回复突变株(back mutant, reverse mutant);基本培养基(minimum medium,MM); 补充培养基(supplemented medium,SM);完全培养基(complete medium,CM)。前体1→A→B→C→D→前体2 途径α β γ 酶↑ ↑ ↑ a b c 基因一个基因一条多肽链筛选营养缺陷型菌株的四个环节: 诱变;淘汰野生型(抗生素法,菌丝过滤法);检出缺陷型(夹层培养法,限量补充法,逐个检出法,影印平板法);鉴定缺陷型(生长谱法)。维生素的生长谱营养缺陷型菌株的应用:赖氨酸,研究代谢途径。氨基酸的生长谱
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研究代谢途径: 粗糙链孢霉(Neurospora crassa) 瓜氨酸- + + 鸟氨酸- - + 突变株Ⅰ 突变株Ⅱ 突变株Ⅲ 精氨酸+ + + 前体→鸟氨酸→瓜氨酸→精氨酸→.. 艾姆氏试验(Ames test):生物的遗传物质是核酸;凡对微生物有效的诱变剂对高等动物同样有效;化学药剂对细菌的诱变率与其对动物的致癌率成正比;凡致癌物质都是诱变剂,但并非所有的诱变剂都能致癌;95%的致癌剂有诱变作用, 约90%的非致癌剂就没有诱变剂的作用。材料:鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型菌株,老鼠肝脏抽提液。
第三节基因重组和基因杂交基因重组(gene recombination) 遗传重组(genetic recombination):两个独立基因组内的遗传基因,通过一定的途径转移到一起,形成新的稳定基因组的过程。原核生物的基因重组转化(transformation) 转导(transduction) 接合(conjugation, mating) 原生质体融合(protoplast fusion) 转化:受体菌直接吸收来自供体菌的DNA 片段,通过交换把他整合到自己的基因组中,从而获得供体菌部分遗传性状的现象。受体细胞(recipient cell, receptor) 供体细胞(donor cell) 转化子(transformant) 
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感受态:受体细胞最易接受外源DNA 片段并实现转化的生理状态。转化的过程:感受态细胞吸收DNA;DNA 掺入细胞后的整合。转化的要求:受体细胞处于感受状态(competence) 转化的特点:直接吸收;受体细胞处于感受态转染(transfection) 转导:通过缺陷噬菌体的媒介,将供体细胞的DNA 片段携带入受体细胞中,通过交换和整合, 使后者获得前者的部分遗传性状。缺陷噬菌体(defective phage) 转导子(transductant) 普遍性转导(generalized transduction):完全缺陷噬菌体。特点:随机包裹;转导子非溶原性。局限性转导(specialized transduction):部分缺陷噬菌体。特点:转导的是特定基因;转导子为缺陷溶原性。普遍性转导和局限性转导的比较普遍性转导和局限性转导的比较普遍转导任何基因能转导的基因不结合到寄主上噬菌体在寄主中的位置获得转化噬菌体的方式转导子的区别通过敏感菌的裂解非溶原性特定基因结合到寄主上通过溶源菌的诱导部分溶原性
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溶源转变lysogenic conversion 接合:供体菌(F+菌株,雄性菌株)通过性菌毛与受体菌(F-菌株,雌性菌株)直接接触,把F 质粒或其携带的不同长度的核基因组片段传递给后者,使后者获得若干新的遗传性状。F+菌株;F-菌株;Hfr 菌株;F’菌株。特点:两细胞直接接触;需要性因子性因子可通过接合获得。原生质体融合:通过人工的方法,使遗传性状不同的两个细胞的原生质体进行融合,从而获得兼有两亲本遗传性状的重组子。原生质体技术的优越性:去掉了细胞壁的障碍,亲株基因组可直接融合、交换,并为链霉菌实现基因转化创造了条件;二亲株的基因组之间可发生多次交换,得到多种类型的重组子, 且参与融合的亲株不限于一个,可以多至3、4 个;重组频率高;可用诱变的方法直接处理原生质体,提高突变率;再生成细胞壁的过程常伴随治理的消除,使染色体发生改变;极其简单,操作方便,不需要贵重药品。
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如何得到原生质体:菌体(菌丝)培养;细胞壁的去除;原生质体的融合(再生); 检出重组子。再生频率的计算: 原生质体数H-原生质体数水再生频率=———————————— 原生质体总数(血球计数) 原生质体技术的应用:利用原生质体形成及再生达到改良亲本的目的(大环内酯类抗生素);利用原生质体诱变提高突变率(庆大霉素);利用原生质体融合获得性的抗生素(Indolizomycin);利用再生,得到了产量提高的变异菌株,例如生二素链霉菌(Streptomytece ambofaciens)通过原生质体再生,螺旋霉素的生产能力提高了三倍多。质粒消除的结果常常导致细胞染色体的改变,或使次级代谢途径发生变化(白霉素和金丝霉素),出现有利于提高抗生素产量的变异菌株。有效的种间融合,使两个产生不同抗生素菌株的调节基因和结构基因重组在一起,诱发一些原来为“沉默基因’的表达,从而产生新物质。同时种间融合还可能使两个产生不同抗生素菌株的结构基因重组而产生杂种抗生素。真核微生物的基因重组有性杂交(sexual hybridization) 准性杂交(parasexual hybridization) 同种而不同菌株的体细胞间发生的融合,常见于半知菌类。准性杂交过程:菌丝联结(anastomosis);形成异核体(heterocaryon);核融合(nuclear fusion);体细胞交换(somatic crossing-over)和单倍化。第四节基因工程基因工程(gene engineering) 遗传工程(genetic eng ineering):人工的离体的分子水平上的遗传重组技术。基本操作:获取目的基因;优良载体的选择; 目的基因与载体DNA 的体外重组;重组载体导入受体细胞(转化);重组受体细胞的筛选和鉴定;工程菌的表达。
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对质粒载体的要求:是一个独立的复制子;具有较多的单一限制性内切酶位点;有方便的筛选标记;具有外源DNA 片段插入失活的附加标记;高拷贝数。应用: 生产多肽类药物:干扰素(interferon),白细胞介素( interleukin ); 生产疫苗:乙肝疫苗; 改造传统工业发酵的菌种; 改良动植物的特性; 用于环境保护的“超级菌”的构建。工程菌的不稳定性。
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第五节菌种的衰退、复壮和保藏菌种的衰退和复壮衰退(degeneration):菌种的特性发生了负变,如生长速度减慢、代谢产物合成能力下降。菌种衰退的原因:自发突变。衰退的防止:控制传代次数;创造良好的培养条件;利用不易衰退的细胞传代; 采用有效的菌种保藏方法。复壮:从已衰退的群体中筛选出少数没有退化的个体。菌种的复壮:纯种分离法(pure culture isolation),包括菌落纯(pure culture in colony lever)和菌株纯( pure culture in strain lever ); 通过寄主体复壮。菌种的保藏菌种保藏的意义:菌种是一个国家极其重要和宝贵的生物资源。菌种保藏的原理:通过保持培养基营养成分在最低水平,缺氧状态,干燥和低温, 使菌种处于“休眠”状态,抑制其繁殖能力。菌种保藏的方法: 斜面冰箱保藏法:斜面保藏是一种短期、过渡的保藏方法,用新鲜斜面接种后, 置最适条件下培养到菌体或孢子生长丰满后,放在4℃冰箱保存。一般保存期为三个月到六个月沙土管保藏法:适合于产孢子或芽孢的微生物。将斜面孢子制成孢子悬浮液接入沙土管中或将斜面孢子刮下直接与沙土混合,置干燥器中用真空泵抽干,放在冰箱内保存。一般保存期为1 年左右。菌丝速冻法:对于不产孢子或芽孢的微生物,一般不能用沙土管保藏。为了方便可以采用甘油菌丝速冻法。由于该法的保藏温度为-20℃,为了避免微生物受损伤致死,需要甘油作为保护剂。甘油的最终浓度为25%。石蜡油封存法:向培养成熟的菌种斜面上,倒入一层灭过菌的石蜡油,用量要高出斜面一厘米,然后保存在冰箱中。此法可适用于不能利用石蜡油作碳源的细菌、霉菌、酵母等微生物的保存。保存期约一年左右。真空冷冻干燥保藏法:目前常用的较理想的一种方法。在真空中使水分升华。微生物的生长和代谢都暂时停止,不易发生变异。菌种保存时间一般5年左右。需要一定的设备。保护剂一般采用脱脂牛奶或血清等。保护剂的作用可能是在冷冻干燥的脱水过程中代替结合水而稳定细胞成分(细胞膜)的构型,防止细胞膜因为冻结而破坏。保护剂还可以起支持作用,使微生物疏松地固定在上面。液氮超低温保藏法:适用范围最广的微生物保藏法。尤其是一些不产孢子的菌丝体,用其它保藏方法不理想,可用液氮保藏法,其保存期最长。原理:用液氮能长期保存菌种。这是因为液氮的温度可达-196℃,远远低于其新陈代谢作用停止的温度(-130℃),所以此时菌种的代谢活动已停止,化学作用亦随之消失。需要保护剂,常用的保护剂为10%甘油。先将菌液降温到0℃,再以每分钟降低1℃的速度,一直降低到-35℃,然后才把装有菌液的安瓿管放入液氮罐的气相中。国内菌种保藏机构中国微生物菌种保藏管理委员会(China Committee for Culture Collection of 
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Microorganisms. CCCMS)委托中国科学院负责担负全国菌种保藏管理业务,下设六个菌种保藏管理中心。l)普通微生物菌种保藏管理中心(CCGMC) 中国科学院微生物研究所,北京(AS):真菌,细菌。中国科学院武汉病毒研究所,武汉(AS—IV):病毒。2)农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC) 中国农业科学院土壤肥料研究所,北京(ISF)。3)工业微生物菌种保藏管理中心(CICC) 轻工业部食品发酵工业科学研究所,北京(IFFI)。4)医学微生物菌种保藏管理中心(CMCC) 中国医学科学院皮肤病研究所,南京(ID):真菌。卫生部药品生物制品检定所,北京(NICPBP):细菌。中国医学科学院病毒研究所,北京:病毒。5)抗生素菌种保藏管理中心(CACC) 中国医学科学院抗生素研究所,北京(IA)。四川抗生素工业研究所,成都(STA):新抗生素菌种。华北药厂抗生素研究所,石家庄(IANP):生产用抗生素菌种。6)兽医微生物菌种保藏管理中心(CVCC) 农业部兽医药品监察所,北京。国外菌种保藏机构l)ATCC American Type Culture Collection. Rockvill. Maryland. U.S.A. 美国标准菌种收藏所,美国,马里兰洲,罗克维尔市。2) CSH Cold Spring Harbor Laboratory. U.S.A. 冷泉港研究室,美国。3) IAM Institute of Applied Microbiology. University of Tokyo, Japan. 日本东京大学应用微生物研究所,日本东京。4) IFO Institute for Fermentation. Osaka, Japan. 发酵研究所,日本大阪。5) KCC Kaken Chemical Company Ltd. Tokyo, Japan. 科研化学有限公司,日本东京。6) NCTC National Collection of Type Culture. London , United Kingdom. 国立标准菌种收藏所,英国伦敦。7) NIH National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, U.S.A. 国立卫生研究所,美国,马里兰洲,贝塞斯达。第一节微生物在自然界中的分布与菌种资源的开发第九章微生物的生态生态学(ecology):研究生命系统和和环境系统间相互作用规律的科学一些概念:生物圈(biosphere);生态系统(ecosystem);群落(community);种群(population);个体(individual);器官(organ);组织(tissue);细胞(cell); 细胞器(organelle);分子(molecule)。微生物生态:各种环境因素对微生物的作用及微生物对外界环境的反作用。微生物在自然界的分布:海陆空。
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个体小;营养类型多;存在休眠体。土壤中的微生物:为什么土壤是微生物的天然培养基?营养丰富;PH 适宜;温度、通气。分布情况:细菌,放线菌,霉菌,酵母菌。水体中的微生物:水中的病原微生物大肠菌群值=1000/大肠菌群数饮用水的标准:总细菌数:<100 个/ml;大肠菌群数:< 3 个/l。空气中的微生物:主要附着在灰尘上。如何检查空气中的微生物:平板检查法;将空气通入水中,检查水中的细菌;尘埃粒子计数器。空气中微生物的处理:空气过滤器;紫外线照射;喷雾消毒。工农业产品中的微生物:工业产品的霉腐;食品上的微生物;农产品上的微生物。极端环境下的微生物:嗜热微生物;嗜冷微生物;嗜酸微生物;嗜碱微生物;嗜盐微生物;嗜压微生物;抗辐射微生物。第二节微生物与生物环境间的关系互生共生寄生拮抗捕食互生(metabiosis):两种可单独生活的生物,当它们在一起时,通过各自的代谢活动而有利于对方,或偏利于一方的生活方式。“可分可合,合比分好” 互生的例子:固氮菌Vs 纤维素分解菌人Vs 肠道中的正常菌群排阻、抑制外来致病菌;产生有助于消化的淀粉酶、蛋白酶;分解有毒物质;营养物质。共生(symbiosis):两种生物共居在一起,相互分工合作,合二为一的极其紧密的一种相互关系。“相依为命,难分难解” 共生的例子:地衣(lichen):真菌与藻类; 根瘤菌与植物;反刍动物(牛)与瘤胃微生物。寄生(parasitism):一种小型生物生活在另一种较大生物体内或体表,从中夺取营养进行生长繁殖,并使后者蒙受损失甚至被杀死的一种相互关系。寄生物(parasite);寄主(host)。寄生的例子:噬菌体与宿主菌;烟草与TMV;人与病原微生物。拮抗(antagonism):某种生物产生的特定代谢产物可抑制其他生物的生长甚至杀死它们的一种相互关系。特异性拮抗;非特异性拮抗。拮抗的例子:青霉菌产生青霉素;乳酸菌产酸。捕食(predatism, predation):一种大型生物直接捕捉、吞食另一种小型生物以满足其营养需要的相互关系。捕食的例子:原生动物与细菌。第三节微生物与环境保护水体的污染——富营养化水体自净:天然水体受到污染后,在无人为处理的条件下,借水体自身的能力得到净化的过程。
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物理作用:稀释,沉降,扩散;化学作用:氧化,还原,分解,凝聚; 生物作用:细菌。富营养化(eutrophication):水华(water bloom),赤潮(red tide)。用微生物治理污水。污水分为生活污水和工业废水。评价水质的指标: 化学需氧量COD(chemical oxygen demand):用强氧化剂使一升污水中所含的有机物氧化所消耗的氧的毫克数。生化需氧量BOD(biochemical oxygen demand):微生物在有足够溶解氧存在的条件下,分解一升污水中所含有机物过程中所消耗的水中溶解氧的毫克数BOD5:20℃,5 天,1 升水溶解氧的减少量。生物的污水处理:完全混合曝气法;活性污泥法;生物膜法。活性污泥(activated sludge):由或细菌、原生动物和其他微生物群聚集在一起组成的凝絮团,在污水处理中具有很强的吸附、分解有机物或有毒物的能力。细菌是分解有机物的主力;细菌聚集成菌胶团,形成絮状物。细菌:吸附有机物,并分解之;吸附金属离子与有机物形成络合物;保护细菌;利于沉降; 原生动物:吞噬游离细菌;吞噬微小污泥;分泌粘性物质;利于絮凝; 霉菌:利于絮凝; 酵母菌:分解氰、酚。预处理:去掉一些大的颗粒、稀释污水;曝气:微生物分解有机物或有毒物;沉淀:出水、回流部分污泥。曝气的原理:是群体的协同作用。生物膜法(biofilm):生长在潮湿、通气的固体表面上的一层由多种活微生物构成的粘滑、暗色菌膜, 能氧化、分解污水中的有机物或某些有毒物。第一节传染第十章传染与免疫传染与传染病。传染(infection):病原微生物侵入机体后,在一定的部位生长、繁殖,从而引起一系列病理生理的过程。由于机体的抵抗力和病原菌两方面的力量不同以及环境因素的影响,有时不表现临床症状,成为隐性传染或带菌状态,有时表现出临床症状——传染病。传染病(infectious disease):可从一个宿主个体直接或间接传播到另一宿主个体的疾病。免疫:抗传染免疫(免疫防护):变态反应;自身稳定功能:自身免疫疾病;免疫监视作用:肿瘤病。
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决定传染结局的三大因素:病原体;宿主的免疫力;环境因素。病原体毒力(virulence),致病力(pathogenicity)。侵袭力(invastiveness):吸附和侵入能力;繁殖与扩散能力;抵抗宿主防御功能的能力。毒素(toxin) 外毒素(exotoxin):病原菌生长过程中不断向外界环境分泌的一类毒性蛋白。毒性强,抗原性强,毒性不稳定(对热和化学物质敏感);0.3-0.4%甲醛脱毒。内毒素(endotoxin):是G-菌细胞壁外层的组分之一,化学成分为脂多糖(LPS), 一般不分泌到环境中。毒性低,抗原性弱,化学稳定性强。热源物质(pyrogen)。入侵病原体的数量;侵入门径(entry point)。宿主的免疫力免疫力(immunity):免疫防御(immunologic defence);免疫稳定(immunologic homeostasis);免疫监视(immunologic serveillance)。环境因素:宿主环境(先天,后天);外界环境;自然环境;社会环境。传染的三种可能结局:隐性传染(inapparent infection);带菌状态(carrier state);显性传染(apparent infection)。
第二节非特异性免疫非特异性免疫(nonspecific immunity);先天免疫(innate immunity);自然免疫(natural immunity)。自然免疫:在生物长期进化过程中形成,属于先天即有、相对稳定、无特殊针对性的对付病原体的天然抵抗力。表皮和屏障结构(barrier structure):机械作用;化学保护作用;正常菌群的拮抗作用;粘膜表面的免疫球蛋白。皮肤与粘膜;血脑屏障(blood-brain barrier):内皮细胞层,细胞间连接紧密, 阻挡病原菌进入脑组织,保护中枢神经系统;血胎屏障(blood-embryo barrier): 母体子宫内膜和胎儿的绒毛膜,防止母体内的病原体进入胎儿。吞噬细胞的吞噬作用吞噬细胞:存在于血液、体液和组织中,能吞噬、杀死和消化病原菌的白细胞。多形核白细胞(polymorphonuclear leukocyte, PMN); 粒细胞(granulocyte):产生于骨髓,完全成熟后进入血流,是一类活动非常积极的重要细胞。急性炎症反应中的重要吞噬细胞。包括嗜中性粒细胞(neutrophil);嗜碱性粒细胞(basophil);嗜酸性粒细胞(eosinophil)。
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巨噬细胞(macrophage, M.):由骨髓干细胞分化而来,在组织中分布广;肝脏、肺、网状结缔组织。吞噬和杀菌作用抗原递呈作用:通过吞噬、处理和传递,对外来抗原物质进行加工,以适应激活淋巴细胞的需要;免疫调节作用:在外来抗原刺激下,产生多种可溶性生物活性物质,进行免疫调节;抗癌作用。炎症反应:炎症(inflammation):机体对病原体的侵入或其他损伤的一种保护反应,在相应部位出现红、肿、热、痛和功能障碍。是病理过程,也是免疫反应。正常体液或组织中的抗菌物质:补体(complement);干扰素(interferons, IFNs) 补体:是血清中的正常成分,有补充抗体作用的能力。有九种不同的成分C1,C2,C3,C4,C5,C6,C7,C8, C9;C1 包括C1q,C1r,C1s。被抗原抗体复合物激活后,可溶解和杀伤细胞,增强吞噬作用。动员大量吞噬细胞聚集在炎症部位; 血流的加速使血液中抗菌因子和抗体发生局部浓缩; 死亡的宿主细胞堆积可释放一部分抗菌物质; 炎症中心部位氧浓度下降和乳酸浓度提高,可抑制多种病原体的生长; 炎症部位体温的升高可降低某些病原体的繁殖速度。
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第三节特异性免疫特异性免疫(specific immunity) 获得性免疫(acquired immunity) 适应性免疫(adaptive immunity):机体针对某一种或一类微生物或其产物所产生的特异性抵抗力,是后天获得的。免疫应答(immune response):发生在活生物体内的特异性免疫的系列反应过程。是抗原、抗体的特异性反应。抗原( antigen, Ag ); 免疫原(immunogen):能刺激诱导机体发生免疫应答并能与相应抗体或T 淋巴细胞受体发生特异性免疫反应的大分子物质。免疫原性(immunogenicity); 抗原性(antigenicity)。免疫反应性(immunoreactivity); 反应原性(reactinogenicity)。半抗原(hapten);不完全抗原(incomplete antigen):只有反应原性,没有免疫性。完全抗原由两部分组成:载体(carrier):化学本质为蛋白质;半抗原。抗原的基本特性:具有一定化学组成和结构的大分子物质。异物性(foreignness):抗原的理化性质与其所刺激的机体的自身物质理化性质之间的差异程度特异性:由分子表面上特定化学基团所决定(抗原决定簇,antigenic determinant)。抗体(antibody):高等动物体在抗原物质的刺激下,由浆细胞产生的一类能与相应抗原在体内外发生特异性结合的免疫球蛋白。抗抗体(antiantibody):具有抗体功能的抗原刺激机体产生的相应的抗体。
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抗体的结构五类抗体:IgG,IgA,IgM,IgD,IgE。
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抗体形成的规律: 两次应答规律:初次免疫应答(primary immune response);再次免疫应答(secondary immune response)。回忆反应抗体出现的顺序:IgM 最早出现,IgA 最晚出现。影响抗体形成的因素: 抗原:是否按抗体形成的规律(亲缘关系,注射次数);机体:本身机体的差异。第四节免疫学方法及其应用抗原抗体反应的一般规律: 特异性:钥匙和锁;可逆性:Ag+Ab←→Ag·Ab; 定比性;阶段性:特异性结合阶段,可见反应阶段;条件依赖性影响抗原抗体间反应的因素: 电解质温度:温度上升,促进分子运动,增加抗原抗体的碰撞机会;但温度过高,抗原抗体解离、变性、破坏。一般最适温度为37 ℃ PH:蛋白质为两性电离性质,Ig 的等电点为PH=5~5.5。一般抗原抗体反应的PH 为6~8。抗原抗体间的主要反应: 凝集反应(agglutination) 直接凝集反应(direct agglutination):颗粒性抗原(完整细菌细胞或血细胞) 与相应的抗体在合适的条件下反应并出现肉眼可见的凝集团现象。凝集原(agglutinogen);凝集素(agglutinin);稀释抗体。
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定性:玻片法,已知抗体测未知抗原,如鉴定血型。
定量:试管法,已知抗原测未知抗体,诊断伤寒、肥达氏试验(Widal test)。间接凝集反应( indirect agglutination):需要载体,吸附可溶性抗原,成为人工的颗粒性抗原。测微量抗体,以增加测量的灵敏度。间接凝集抑制反应:将可溶性抗原与抗体混合,充分作用后再加入载体吸附相应的抗体。若此时抗体已被抗原中和,则不再发生凝集。用于检测抗原。如妊娠试验:孕妇尿中有绒毛膜促性腺激素HCG(抗原);尿+HCG 抗体; 再加入HCG 覆盖的红细胞。若尿中有HCG,HCG 与HCG 抗体接合,样品中无游离HCG 抗体。未出现沉淀,即发生凝集抑制,怀孕;出现沉淀,即未发生凝集抑制,未怀孕。
沉淀反应(precipitation):可溶性抗原与其相应的抗体在合适的条件下反应, 并出现肉眼可见的沉淀物。沉淀原(precipitonogen);沉淀素(precipitin);稀释抗原。环状沉淀反应(ring precipitation) 环状试验(ring test):用于抗原的定性;如鉴定血迹。絮状沉淀反应(flocculation precipitation):絮状反应,抗原与相应抗体在试管中或凹玻片上混匀,经过一段时间后,出现肉眼可见的絮状沉淀。如康氏试验(Kahn test)诊断梅毒。琼脂扩散法(agar diffusion) 免疫扩散法(immuno-diffusion)可溶性抗原与相应的抗体在半固体琼脂内扩散并进行沉淀反应。单向琼脂扩散( simple agar diffusion )定量测定抗原双相琼脂扩散( double agar diffusion )定性分析抗原或抗体对流免疫电泳(counter immuno-electrophoresis, CIE) 抗原和抗体分别置于凝胶板电场的正负极的小孔内,通电后抗原向正极移动而抗体向负极移动,在两孔间合适的抗原抗体浓度处会形成一条沉淀线。双相琼脂扩散与电泳技术的结合。 40 华东理工大学《微生物学教程》上课讲义火箭电泳法(rocket electrophoresis) 在已混有抗体的凝胶板上的小孔内加入抗原并进行电泳,在沿着电泳方向会形成火箭型沉淀线。已知标准抗原量可方便地测定未知标本中的抗原量。单相琼脂扩散与电泳技术的结合。双向免疫电泳(two dimentional immuno-electrophoresis) 免疫电泳与火箭点泳的结合。补体结合反应(complement fixation test) 有补体参与,并以绵羊红细胞和溶血素(红细胞的特异性抗体)是否发生溶血反应作指示的一种高灵敏度的抗原抗体的结合反应。2 个系统,5 种成分免疫荧光技术(immunofluorescens technique) 荧光抗体法(fluorescent antibody technique):抗体与荧光素结合形成荧光抗体。免疫酶技术( immunoenzymatic technique) 酶免疫测定法(enzyme immunoassay): 用酶作标记的抗体或抗抗体,进行抗原抗体反应的高灵敏度的免疫标记技术。
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放射免疫测定法(radioimmuno-assay):利用放射性同位素标记抗原或抗体。免疫反应的应用: 预防接种自动免疫和被动免疫的区别(见下表) 自动免疫被动免疫免疫产生较慢立即获得免疫体内可持续产生抗体抗体量不超过注射量再接受抗原增加反应无增加反应维持时间较长维持时间较短用于预防用于应急用于治疗:疫苗:类毒素(白喉类毒素、破伤风类毒素);免疫血清(抗毒素、丙种球蛋白);活疫苗:卡介苗,甲肝疫苗,脊髓灰质疫苗;死疫苗:百日咳,伤寒, 霍乱,乙脑,乙肝; 用于诊断;用于微生物分类。变态反应(allergy) 超敏反应(hypersensitivity):机体受同一抗原物质再次刺激后产生的一种异常的或病理性的,以组织损伤或生理功能紊乱为表现的免疫反应。变应原(allergen):完全抗原、半抗原完全抗原:异种血清蛋白,微生物,寄生虫,花粉,鱼,虾。半抗原:青霉素半抗原进入机体与组织结合成为完全抗原。变态反应的发生:变应原的剂量;进入体内的途径;机体免疫机能的状态。过敏反应:变应原与固定在细胞(肥大细胞)上的特异性抗体结合,使细胞释放过敏介质,从而引起效应器官生理功能紊乱。个体差异明显;反应快,消失也快;反应发生重;抗体为IgE。
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青霉素过敏反应: 青霉素分子(β-内酰胺环中的羧基)直接与人体内蛋白中的氨基结合,形成青霉噻唑蛋白。青霉素降解产物(青霉烯酸)与人体蛋白质结合。防治变态反应: 检出过敏原并避免接触; 脱敏治疗:小量多次注射某过敏原进行脱敏。例如:破伤风抗过敏药物;抗组胺药物:扑尔敏,息斯敏。 (责任编辑:泉水)
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