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生化实验讲义(理论部分)二--生物大分子的制备

时间:2005-12-31 22:40来源:Internet 作者:admin 阅读:

2.1 概述
  生物大分子主要是指蛋白质、酶(也是一种蛋白质)和核酸,这三类物质是生命活动的物质基础。在自然科学,尤其是生命科学高度发展的今天,蛋白质、酶和核酸等生物大分子的结构与功能的研究是探求生命奥秘的中心课题,而生物大分子结构与功能的研究,必须首先解决生物大分子的制备问题,没有能够达到足够纯度的生物大分子的制备工作为前题,结构与功能的研究就无从谈起。然而生物大分子的分离纯化与制备是一件十分细致而困难的工作,有时制备一种高纯度的蛋白质、酶或核酸,要付出长期和艰苦的努力。
  与化学产品的分离制备相比较,生物大分子的制备有以下主要特点:
  ⑴生物材料的组成极其复杂,常常包含有数百种乃至几千种化合物。其中许多化合物至今还是个谜,有待人们研究与开发。有的生物大分子在分离过程中还在不断的代谢,所以生物大分子的分离纯化方法差别极大,想找到一种适合各种生物大分子分离制备的标准方法是不可能的。
  ⑵许多生物大分子在生物材料中的含量极微,只有万分之一、几十万分之一,甚至几百万分之一。分离纯化的步骤繁多,流程又长,有的目的产物要经过十几步、几十步的操作才能达到所需纯度的要求。例如由脑垂体组织取得某些激素的释放因子,要用几吨甚至几十吨的生物材料,才能提取出几毫克的样品。
  ⑶许多生物大分子一旦离开了生物体内的环境时就极易失活,因此分离过程中如何防止其失活,就是生物大分子提取制备最困难之处。过酸、过碱、高温、剧烈的搅拌、强辐射及本身的自溶等都会使生物大分子变性而失活,所以分离纯化时一定要选用最适宜的环境和条件。
  ⑷生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的,温度、pH值、离子强度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响,很难准确估计和判断,因而实验结果常有很大的经验成份,实验的重复性较差,个人的实验技术水平和经验对实验结果会有较大的影响。
  由于生物大分子的分离和制备是如此的复杂和困难,因而实验方法和流程的设计就必须尽可能多查文献,多参照前人所作的工作,吸取其经验和精华,探索中的失败和反复是不可避免的,只有具有百折不挠的钻研精神才能达到预期的目的。
  生物大分子的制备通常可按以下步骤进行:①确定要制备的生物大分子的目的和要求,是进行科研、开发还是要发现新的物质。②建立相应的可靠的分析测定方法,这是制备生物大分子的关键,因为它是整个分离纯化过程的“眼睛”。③通过文献调研和预备性实验,掌握生物大分子目的产物的物理化学性质。④生物材料的破碎和预处理。⑤分离纯化方案的选择和探索,这是最困难的过程。⑥生物大分子制备物的均一性(即纯度)的鉴定,要求达到一维电泳一条带,二维电泳一个点,或HPLC和毛细管电泳都是一个峰。⑦产物的浓缩,干燥和保存。
  分析测定的方法主要有两类:即生物学和物理、化学的测定方法。生物学的测定法主要有酶的各种测活方法、蛋白质含量的各种测定法、免疫化学方法、放射性同位素示踪法等;物理、化学方法主要有比色法、气相色谱和液相色谱法、光谱法(紫外/可见、红外和荧光等分光光度法)、电泳法、以及核磁共振等。实际操作中尽可能多用仪器分析方法,以使分析测定更加快速、简便。
  生物大分子制备物的均一性(即纯度)的鉴定,通常只采用一种方法是不够的,必须同时采用2~3种不同的纯度鉴定法才能确定。蛋白质和酶制成品纯度的鉴定最常用的方法是:SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和等电聚焦电泳,如能再用高效液相色谱(HPLC)和毛细管电泳(CE)进行联合鉴定则更为理想,必要时再做N-末端氨基酸残基的分析鉴定,过去曾用的溶解度法和高速离心沉降法,现已很少再用。核酸的纯度鉴定通常采用琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳,但最方便的还是紫外吸收法,即测定样品在pH 7.0时260nm与280nm的吸光度(A260和A280),从A260/A280的比值即可判断核酸样品的纯度。
  要了解的生物大分子的物理、化学性质主要有:①在水和各种有机溶剂中的溶解性。②在不同温度、pH值和各种缓冲液中生物大分子的稳定性。③固态时对温度、含水量和冻干时的稳定性。④各种物理性质:如分子的大小、穿膜的能力、带电的情况、在电场中的行为、离心沉降的表现、在各种凝胶、树脂等填料中的分配系数等。⑤其他化学性质:如对各种蛋白酶、水解酶的稳定性和对各种化学试剂的稳定性。⑥对其他生物分子的特殊亲和力等。
  制备生物大分子的分离纯化方法多种多样,主要是利用它们之间特异性的差异,如分子的大小、形状、酸碱性、溶解性、溶解度、极性、电荷和与其他分子的亲和性等。各种方法的基本原理基本上可以归纳为两个方面:一是利用混合物中几个组分分配系数的差异,把它们分配到两个或几个相中,如盐析、有机溶剂沉淀、层析和结晶等;二是将混合物置于某一物相(大多数是液相)中,通过物理力场的作用,使各组分分配于不同的区域,从而达到分离的目的,如电泳、离心、超滤等,目前纯化蛋白质等生物大分子的关键技术是电泳、层析和高速与超速离心。由于生物大分子不能加热熔化和汽化,因而所能分配的物相只限于固相和液相,在此两相之间交替进行分离纯化。在实际工作中往往要综合运用多种方法,才能制备出高纯度的生物大分子。
  纯化生物大分子总是希望纯度和产率都要高。例如纯化某种酶,理想的结果是比活力和总回收率都要高才好,但实际上两者不能兼得,通常在科研上希望比活力尽可能的高,而牺牲一些回收率,在工业生产上则正相反。

2.2 生物大分子制备的前处理
2.2.1 生物材料的选择 
  制备生物大分子,首先要选择适当的生物材料。材料的来源无非是动物、植物和微生物及其代谢产物。从工业生产角度选择材料,应选择含量高、来源丰富、制备工艺简单、成本低的原料,但往往这几方面的要求不能同时具备,含量丰富但来源困难,或含量来源较理想,但材料的分离纯化方法繁琐,流程很长,反倒不如含量低些但易于获得纯品的材料,由此可见,必须根据具体情况,抓住主要矛盾决定取舍。从科研工作的角度选材,则只须考虑材料的选择符合实验预定的目标要求即可。除此之外,选材还应注意植物的季节性、地理位置和生长环境等。选动物材料时要注意其年龄、性别、营养状况、遗传素质和生理状态等。动物在饥饿时,脂类和糖类含量相对减少,有利于生物大分子的提取分离。选微生物材料时要注意菌种的代数和培养基成分等之间的差异,例如在微生物的对数期,酶和核酸的含量较高,可获得较高的产量。
  材料选定后要尽可能保持新鲜,尽快加工处理,动物组织要先除去结缔组织、脂肪等非活性部分,绞碎后在适当的溶剂中提取,如果所要求的成分在细胞内,则要先破碎细胞。植物要先去壳、除脂。微生物材料要及时将菌体与发酵液分开。生物材料如暂不提取,应冰冻保存。动物材料则需深度冷冻保存。
2.2.2 细胞的破碎
  除了某些细胞外的多肽激素和某些蛋白质与酶以外,对于细胞内或多细胞生物组织中的各种生物大分子的分离纯化,都需要事先将细胞和组织破碎,使生物大分子充分释放到溶液中,并不丢失生物活性。不同的生物体或同一生物体的不同部位的组织,其细胞破碎的难易不一,使用的方法也不相同,如动物脏器的细胞膜较脆弱,容易破碎,植物和微生物由于具有较坚固的纤维素、半纤维素组成的细胞壁,要采取专门的细胞破碎方法。
  (1)机械法:
1) 研磨:将剪碎的动物组织置于研钵或匀浆器中,加入少量石英砂研磨或匀浆,即可将动物细胞破碎,这种方法比较温和,适宜实验室使用。工业生产中可用电磨研磨。细菌和植物组织细胞的破碎也可用此法。
2) 组织捣碎器:这是一种较剧烈的破碎细胞的方法,通常可先用家用食品加工机将组织打碎,然后再用10000r/min~20000r/min的内刀式组织捣碎机(即高速分散器)将组织的细胞打碎,为了防止发热和升温过高,通常是转10秒~20秒,停10秒~20秒,可反复多次。
  (2)物理法:
1) 反复冻融法:将待破碎的细胞冷至-15℃到-20℃,然后放于室温(或40℃)迅速融化,如此反复冻融多次,由于细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎。
2) 超声波处理法:此法是借助超声波的振动力破碎细胞壁和细胞器。破碎微生物细菌和酵母菌时,时间要长一些,处理的效果与样品浓度和使用频率有关。使用时注意降温,防止过热。
3) 压榨法:这是一种温和的、彻底破碎细胞的方法。在1000×105Pa~2000×105Pa 的高压下使几十毫升的细胞悬液通过一个小孔突然释放至常压,细胞将彻底破碎。这是一种较理想的破碎细胞的方法,但仪器费用较高。
4) 冷热交替法:从细菌或病毒中提取蛋白质和核酸时可用此法。在90℃左右维持数分钟,立即放入冰浴中使之冷却,如此反复多次,绝大部分细胞可以被破碎。
  (3)化学与生物化学方法:
1) 自溶法:将新鲜的生物材料存放于一定的pH和适当的温度下,细胞结构在自身所具有的各种水解酶(如蛋白酶和酯酶等)的作用下发生溶解,使细胞内含物释放出来,此法称为自溶法。使用时要特别小心操作,因为水解酶不仅可以使细胞壁和膜破坏,同时也可能会把某些要提取的有效成分分解了。
2) 溶胀法:细胞膜为天然的半透膜,在低渗溶液和低浓度的稀盐溶液中,由于存在渗透压差,溶剂分子大量进入细胞,将细胞膜胀破释放出细胞内含物。
3) 酶解法:利用各种水解酶,如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶和酯酶等,于37℃,pH8,处理15分钟,可以专一性地将细胞壁分解,释放出细胞内含物,此法适用于多种微生物。例如从某些细菌细胞提取质粒DNA时,可采用溶菌酶(来自蛋清)破细胞壁,而在破酵母细胞时,常采用蜗牛酶(来自蜗牛),将酵母细胞悬于0.1mmol/L 柠檬酸一磷酸氢二钠缓冲液(pH=5.4)中,加1%蜗牛酶,在30℃处理30分钟,即可使大部分细胞壁破裂,如同时加入0.2%疏基乙醇效果会更好。此法可以与研磨法联合使用。
4) 有机溶剂处理法:利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶剂或SDS(十二烷基硫酸钠)等表面活性剂处理细胞,可将细胞膜溶解,从而使细胞破裂,此法也可以与研磨法联合使用。

2.2.3 生物大分子的提取
  “提取”是在分离纯化之前将经过预处理或破碎的细胞置于溶剂中,使被分离的生物大分子充分地释放到溶剂中,并尽可能保持原来的天然状态不丢失生物活性的过程。这一过程是将目的产物与细胞中其他化合物和生物大分子分离,即由固相转入液相,或从细胞内的生理状况转入外界特定的溶液中。
  影响提取的因素主要有:目的产物在提取的溶剂中溶解度的大小;由固相扩散到液相的难易;溶剂的pH值和提取时间等。一种物质在某一溶剂中溶解度的大小与该物质的分子结构及使用的溶剂的理化性质有关。一般地说,极性物质易溶于极性溶剂,非极性物质易溶于非极性溶剂;碱性物质易溶于酸性溶剂,酸性物质易溶于碱性溶剂;温度升高,溶解度加大,远离等电点的pH值,溶解度增加。提取时所选择的条件应有利于目的产物溶解度的增加和保持其生物活性。

⑴ 水溶液提取:
  蛋白质和酶的提取一般以水溶液为主。稀盐溶液和缓冲液对蛋白质的稳定性好,溶解度大,是提取蛋白质和酶最常用的溶剂。用水溶液提取生物大分子应注意的几个主要影响因素是:
  1) 盐浓度(即离子强度):离子强度对生物大分子的溶解度有极大的影响,有些物质,如DNA-蛋白复合物,在高离子强度下溶解度增加,而另一些物质,如RNA-蛋白复合物,在低离子强度下溶解度增加,在高离子强度下溶解度减小。绝大多数蛋白质和酶,在低离子强度的溶液中都有较大的溶解度,如在纯水中加入少量中性盐,蛋白质的溶解度比在纯水时大大增加,称为“盐溶”现象。但中性盐的浓度增加至一定时,蛋白质的溶解度又逐渐下降,直至沉淀析出,称为“盐析”现象。盐溶现象的产生主要是少量离子的活动,减少了偶极分子之间极性基团的静电吸引力,增加了溶质和溶剂分子间相互作用力的结果。所以低盐溶液常用于大多数生化物质的提取。通常使用0.02 mol/L ~0.05 mol/L 缓冲液或0.09 mol/L ~0.15 mol/L NaCl 溶液提取蛋白质和酶。不同的蛋白质极性大小不同,为了提高提取效率,有时需要降低或提高溶剂的极性。向水溶液中加入蔗糖或甘油可使其极性降低,增加离子强度(如加入KCl、NaCl、NH4Cl或(NH4)2SO4)可以增加溶液的极性。
  2) pH值:蛋白质、酶与核酸的溶解度和稳定性与pH值有关。过酸、过碱均应尽量避免,一般控制在pH=6~8范围内,提取溶剂的pH应在蛋白质和酶的稳定范围内,通常选择偏离等电点的两侧。碱性蛋白质选在偏酸一侧,酸性蛋白质选在偏碱的一侧,以增加蛋白质的溶解度,提高提取效果。例如胰蛋白酶为碱性蛋白质,常用稀酸提取,而肌肉甘油醛-3-磷酸脱氢酶属酸性蛋白质,则常用稀碱来提取。
  3) 温度:为防止变性和降解,制备具有活性的蛋白质和酶,提取时一般在0℃~5℃的低温操作。但少数对温度耐受力强的蛋白质和酶,可提高温度使杂蛋白变性,有利于提取和下一步的纯化。
  4) 防止蛋白酶或核酸酶的降解作用:在提取蛋白质、酶和核酸时,常常受自身存在的蛋白酶或核酸酶的降解作用而导致实验的失败。为防止这一现象的发生,常常采用加入抑制剂或调节提取液的pH、离子强度或极性等方法使这些水解酶失去活性,防止它们对欲提纯的蛋白质、酶及核酸的降解作用。例如在提取DNA时加入EDTA络合DNAase活化所必须的Mg++。
  5) 搅拌与氧化:搅拌能促使被提取物的溶解,一般采用温和搅拌为宜,速度太快容易产生大量泡沫,增大了与空气的接触面,会引起酶等物质的变性失活。因为一般蛋白质都含有相当数量的巯基,有些巯基常常是活性部位的必需基团,若提取液中有氧化剂或与空气中的氧气接触过多都会使巯基氧化为分子内或分子间的二硫键,导致酶活性的丧失。在提取液中加入少量巯基乙醇或半胱氨酸以防止巯基氧化。
⑵ 有机溶剂提取
  一些和脂类结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶难溶于水、稀盐、稀酸、或稀碱中,常用不同比例的有机溶剂提取。常用的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、正丁酮等,这些溶剂可以与水互溶或部分互溶,同时具有亲水性和亲脂性,其中正丁醇在0℃时在水中的溶解度为10.5%,40℃时为6.6%,同时又用具有较强的亲脂性,因此常用来提取与脂结合较牢或含非极性侧链较多的蛋白质、酶和脂类。例如植物种子中的玉蜀黍蛋白、麸蛋白,常用70%~80%的乙醇提取,动物组织中一些线粒体及微粒上的酶常用丁醇提取。
  有些蛋白质和酶既溶于稀酸、稀碱,又能溶于含有一定比例的有机溶剂的水溶液中,在这种情况下,采用稀的有机溶液提取常常可以防止水解酶的破坏,并兼有除去杂质提高纯化效果的作用。例如,胰岛素可溶于稀酸、稀碱和稀醇溶液,但在组织中与其共存的糜蛋白酶对胰岛素有极高的水解活性,因而采用6.8%乙醇溶液并用草酸调溶液的pH为2.5~3.0,进行提取,这样就从下面三个方面抑制了糜蛋白酶的水解活性:①6.8%的乙醇可以使糜蛋白酶暂时失活;②草酸可以除去激活糜蛋白酶的Ca++;③选用pH2.5~3.0,是糜蛋白酶不宜作用的pH值。以上条件对胰岛素的溶解和稳定性都没有影响,却可除去一部分在稀醇与稀酸中不溶解的杂蛋白。

(责任编辑:泉水)
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