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生化实验讲义(理论部分)二--生物大分子的制备(3)

时间:2005-12-31 22:40来源:Internet 作者:admin 阅读:

2.3.2 透析
  自Thomas Graham 1861年发明透析方法至今已有一百多年。透析已成为生物化学实验室最简便最常用的分离纯化技术之一。在生物大分子的制备过程中,除盐、除少量有机溶剂、除去生物小分子杂质和浓缩样品等都要用到透析的技术。
  透析只需要使用专用的半透膜即可完成。通常是将半透膜制成袋状,将生物大分子样品溶液置入袋内,将此透析袋浸入水或缓冲液中,样品溶液中的大分子量的生物大分子被截留在袋内,而盐和小分子物质不断扩散透析到袋外,直到袋内外两边的浓度达到平衡为止。保留在透析袋内未透析出的样品溶液称为“保留液”,袋(膜)外的溶液称为“渗出液”或“透析液”。
  透析的动力是扩散压,扩散压是由横跨膜两边的浓度梯度形成的。透析的速度反比于膜的厚度,正比于欲透析的小分子溶质在膜内外两边的浓度梯度,还正比于膜的面积和温度,通常是4℃透析,升高温度可加快透析速度。
  透析膜可用动物膜和玻璃纸等,但用的最多的还是用纤维素制成的透析膜,目前常用的是美国Union Carbide (联合碳化物公司)和美国光谱医学公司生产的各种尺寸的透析管,截留分子量MwCO(即留在透析袋内的生物大分子的最小分子量,缩写为MwCO)通常为1万左右。
  商品透析袋制成管状,其扁平宽度为23 mm~50 mm不等。为防干裂,出厂时都用10%的甘油处理过,并含有极微量的硫化物、重金属和一些具有紫外吸收的杂质,它们对蛋白质和其它生物活性物质有害,用前必须除去。可先用50%乙醇煮沸1小时,再依次用50%乙醇、0.01 mol/L碳酸氢钠和0.001 mol/L EDTA溶液洗涤,最后用蒸馏水冲洗即可使用。实验证明,50%乙醇处理对除去具有紫外吸收的杂质特别有效。使用后的透析袋洗净后可存于4℃蒸馏水中,若长时间不用,可加少量NaN2,以防长菌。洗净凉干的透析袋弯折时易裂口,用时必须仔细检查,不漏时方可重复使用。
  新透析袋如不作如上的特殊处理,则可用沸水煮五至十分钟,再用蒸馏水洗净,即可使用。使用时,一端用橡皮筋或线绳扎紧,也可以使用特制的透析袋夹夹紧,由另一端灌满水,用手指稍加压,检查不漏,方可装入待透析液,通常要留三分之一至一半的空间,以防透析过程中,透析的小分子量较大时,袋外的水和缓冲液过量进入袋内将袋涨破。含盐量很高的蛋白质溶液透析过夜时,体积增加50%是正常的。为了加快透析速度,除多次更换透析液外,还可使用磁子搅拌。透析的容器要大一些,可以使用大烧杯、大量筒和塑料桶。小量体积溶液的透析,可在袋内放一截两头烧园的玻璃棒或两端封口的玻璃管,以使透析袋沉入液面以下。
  检查透析效果的方法是:用1% BaCl2检查(NH4)2SO4,用1% AgNO3 检查NaCl、KCl等。
  为了提高透析效率,还可以使用各种透析装置。使用者也可以自行设计与制作各种简易的透析装置。美国生物医学公司(Biomed Instruments Inc.)生产的各种型号的Zeineh 透析器,由于使用对流透析的原理,使透析速度和效率大大提高。
2.3.3 超滤
  超过滤即超滤,自20年代问世后,直至60年代以来发展迅速,很快由实验室规模的分离手段发展成重要的工业单元操作技术。超滤现已成为一种重要的生化实验技术,广泛用于含有各种小分子溶质的各种生物大分子(如蛋白质、酶、核酸等)的浓缩、分离和纯化。
  超滤是一种加压膜分离技术,即在一定的压力下,使小分子溶质和溶剂穿过一定孔径的特制的薄膜,而使大分子溶质不能透过,留在膜的一边,从而使大分子物质得到了部分的纯化。
  超滤根据所加的操作压力和所用膜的平均孔径的不同,可分为微孔过滤、超滤和反渗透三种。微孔过滤所用的操作压通常小于4×104 Pa,膜的平均孔径为500埃~14微米(1微米=104埃),用于分离较大的微粒、细菌和污染物等。超滤所用操作压为4×104 Pa~7×105 Pa,膜的平均孔径为10—100埃,用于分离大分子溶质。反渗透所用的操作压比超滤更大,常达到35×105 Pa~140×105 Pa,膜的平均孔径最小,一般为10埃以下,用于分离小分子溶质,如海水脱盐,制高纯水等。
  超滤技术的优点是操作简便,成本低廉,不需增加任何化学试剂,尤其是超滤技术的实验条件温和,与蒸发、冰冻干燥相比没有相的变化,而且不引起温度、pH的变化,因而可以防止生物大分子的变性、失活和自溶。
  在生物大分子的制备技术中,超滤主要用于生物大分子的脱盐、脱水和浓缩等。
  超滤法也有一定的局限性,它不能直接得到干粉制剂。对于蛋白质溶液,一般只能得到10~50%的浓度。
  超滤技术的关键是膜。膜有各种不同的类型和规格,可根据工作的需要来选用。早期的膜是各向同性的均匀膜,即现在常用的微孔薄膜,其孔径通常是0.05m 和0.025m。近几年来生产了一些各向异性的不对称超滤膜,其中一种各向异性扩散膜是由一层非常薄的、具有一定孔径的多孔“皮肤层”(厚约0.1m ~1.0m ),和一层相对厚得多的(约1m )更易通渗的、作为支撑用的“海绵层”组成。皮肤层决定了膜的选择性,而海绵层增加了机械强度。由于皮肤层非常薄,因此高效、通透性好、流量大,且不易被溶质阻塞而导致流速下降。常用的膜一般是由乙酸纤维或硝酸纤维或此二者的混合物制成。近年来为适应制药和食品工业上灭菌的需要,发展了非纤维型的各向异性膜,例如聚砜膜、聚砜酰胺膜和聚丙烯腈膜等。这种膜在pH 1~14都是稳定的,且能在90℃下正常工作。超滤膜通常是比较稳定的,若使用恰当,能连续用1~2年。暂时不用,可浸在1%甲醛溶液或0.2% 叠氮化钠NaN3中保存。
  超滤膜的基本性能指标主要有:水通量(cm3/(cm2•h));截留率(以百分率%表示);化学物理稳定性(包括机械强度)等。
  超滤装置一般由若干超滤组件构成。通常可分为板框式、管式、螺旋卷式和中空纤维式四种主要类型。由于超滤法处理的液体多数是含有水溶性生物大分子、有机胶体、多糖及微生物等。这些物质极易粘附和沉积于膜表面上,造成严重的浓差极化和堵塞,这是超滤法最关键的问题,要克服浓差极化,通常可加大液体流量,加强湍流和加强搅拌。
  国外生产超滤膜和超滤装置最有名的厂家是美国的Milipore公司和德国的Sartorius公司。国内主要的研究机构和生产厂家是:中科院生态环境研究中心、杭州淡化和水处理开发中心、兰州膜科学技术研究所、无锡化工研究所、上海医药工业研究所、天津膜分离工程研究所、北京化工厂、常熟膜分离实验厂、无锡市超滤设备厂、无锡纯水设备厂、天津超滤设备厂、湖北沙市水处理设备厂等。从膜的品种,以及从某些研究工作的深度方面看,我国与世畀先进国家的差距不很大,但在膜的质量性能及商品化方面尚有较大差距。
  在生物制品中应用超滤法有很高的经济效益,例如供静脉注射的25%人胎盘血白蛋白(即胎白)通常是用硫酸铵盐析法、透析脱盐、真空浓缩等工艺制备的,该工艺流程硫酸铵耗量大,能源消耗多,操诈时间长,透析过程易产生污染。改用超滤工艺后,平均回收率可达97.18%;吸附损失为1.69%;透过损失为1.23%;截留率为98.77%。大幅度提高了白蛋白的产量和质量,每年可节省硫酸铵6.2吨,自来水16000吨。
  超滤技术的应用有很好的前景,应引起足够的重视。
2.3.4 冰冻干燥
  冰冻干燥机是生化与分子生物学实验室必备的仪器之一,因为大多数生物大分子分离纯化后的最终产品多数是水溶液,要从水溶液中得到固体产品,最好的办法就是冰冻干燥,因为生物大分子容易失活,通常不能使用加热蒸发浓缩的方法。
  冰冻干燥是先将生物大分子的水溶液冰冻,然后在低温和高真空下使冰升华,留下固体干粉。
  冰冻干燥得到的生物大分子固体样品有突出的优点:①由于是由冰冻状态直接升华为汽态,所以样品不起泡,不暴沸。②得到的干粉样品不粘壁,易取出。③冰干后的样品是疏松的粉末,易溶于水。
  冰冻干燥特别适用于那些对热敏感、易吸湿、易氧化及溶剂蒸发时易产生泡沫而引起变性的生物大分子,如蛋白质、酶、核酸、抗菌素和激素等。对于极个别的在冻干时易变性失活的生物大分子则要十分谨慎,务必先做小量试验证明冻干无害后方可进行大量处理。
  冰冻干燥机的国产品牌近年来发展很快。如北京的军事医学科学院生产的小型、中型和大型工业用冰干机,已可以取代昂贵的进口产品。在实验室中还可以自已组装小型简易的冰冻干燥器。①准备一个较大的玻璃真空干燥器,将样品置于小培养皿中速冻后放入干燥器内,器内已事先用两个小培养皿分别盛有KOH(或NaOH) 和 P2O5,干燥器通过一个两端塞上棉花其中装满P2O5的干燥管与真空泵相连,抽真空后,经过5~10小时就可以得到冰冻干燥的样品。②将样品溶液置于一个园底烧并内,将烧并浸入干冰~乙醇低温浴(-60℃)中,样品即被速冻成冰块,将烧并标准磨口通过磨口管与一个冷阱相连,冷阱内放有干冰~乙醇混合液,冷阱的另一个出口管与真空泵相连,抽真空时汽化的水汽就冻结在冷阱的内壁上,抽真空数小时后即可在烧并中得到冻干的样品。此简易装置也可用于冻干含有少量乙醇、甲醇、丙酮等常用有机溶剂的样品,可重复以下的操作除去这些有机溶剂:样品速冻→→抽真空至恒定→→使样品升温至室温挥发有机溶剂→→再速冻样品,如此反复多次,以除尽有机溶剂,否则样品不易冻干,且泵前应装有保护真空泵的缓冲并,以吸收水份和有机溶剂。
冰冻干燥特别适用于那些对热敏感、易吸湿、易氧化及溶剂蒸发时易产生泡沫而引起变性的生物大分子,如蛋白质、酶、核酸、抗菌素和激素等。对于极个别的在冻干时易变性失活的生物大分子则要十分谨慎,务必先做小量试验证明冻干无害后方可进行大量处理。
  冰冻干燥机的国产品牌近年来发展很快。如北京的军事医学科学院生产的小型、中型和大型工业用冰干机,已可以取代昂贵的进口产品。在实验室中还可以自已组装小型简易的冰冻干燥器。①准备一个较大的玻璃真空干燥器,将样品置于小培养皿中速冻后放入干燥器内,器内已事先用两个小培养皿分别盛有KOH(或NaOH) 和 P2O5,干燥器通过一个两端塞上棉花其中装满P2O5的干燥管与真空泵相连,抽真空后,经过5~10小时就可以得到冰冻干燥的样品。②将样品溶液置于一个园底烧并内,将烧并浸入干冰~乙醇低温浴(-60℃)中,样品即被速冻成冰块,将烧并标准磨口通过磨口管与一个冷阱相连,冷阱内放有干冰~乙醇混合液,冷阱的另一个出口管与真空泵相连,抽真空时汽化的水汽就冻结在冷阱的内壁上,抽真空数小时后即可在烧并中得到冻干的样品。此简易装置也可用于冻干含有少量乙醇、甲醇、丙酮等常用有机溶剂的样品,可重复以下的操作除去这些有机溶剂:样品速冻→→抽真空至恒定→→使样品升温至室温挥发有机溶剂→→再速冻样品,如此反复多次,以除尽有机溶剂,否则样品不易冻干,且泵前应装有保护真空泵的缓冲并,以吸收水份和有机溶剂。冰冻干燥操作虽然十分简单,但以下的注意事项却必须认真记取:
  ⑴样品溶液:①样品要溶于水,不含有机溶剂,否则会造成冰点降低,冰冻的样品容易融化,因而减压时会起大量泡沫,使样品变性、污染和损失。同时若含有有机溶剂,被抽入真空泵后溶于真空泵油,使其可达真空度降低而必须换油。②样品要予先脱盐,不可使盐浓度过高,否则冰冻后易融化,影响样品活性,而且不易冻干。③样品缓冲液在冰冻时pH可能会有较大变化,例如pH 7.0的磷酸盐缓冲液在冰冻时,磷酸氢二钠比磷酸二氢钠先冻结,因而使溶液pH下降而接近3.5,使某些对低pH敏感的酶变性失活,此时需加入pH稳定剂,如糖类和钙离子等。④样品溶液的浓度不要过稀,例如蛋白质的浓度不低于15 mg/mL 为宜。同批冻干的样品液浓度不宜相差太大,以免冻干的时间相差过大。
  ⑵装样品溶液的容器:①最好用各种尺寸的培养皿盛样品溶液,液层不要太厚,以免冻干时间太长,耗电太多。也可以使用安瓿并和青霉素小并。用烧杯时液层厚度不要超过2 cm,否则烧杯易冻裂。②冻干稀溶液时会得到很轻的绒毛状固体样品,容易飞散而损失和造成污染,因而要用刺了孔的薄膜或吸水纸包住杯口,刺的孔不要过小过少,否则会影响冻干速度。
  ⑶溶液冰冻:如有条件,尽可能用干冰~乙醇低温浴速冻,如能将盛有样品溶液的容器边冻边旋转形成很薄的冰冻层,则可以大大加快冻干的速度。
  ⑷冻干:①样品全部冻干前,不要轻易摇动,以防水蒸汽冲散冻干的样品粉末。②样品冻干达到较高真空度时,容器外部有时会结霜,若外霜消失,则说明样品已冻干,或是仅剩样品中心的小冰块,再稍加延长冻干时间即可。③冻干后要及时取出样品,以免样品在室温下仃留时间过长而失活。④仃真空泵时要先放气,以免泵油倒灌。放气时要缓慢,以免气流冲散样品干粉。⑤样品冻干后要及时密封冷藏,以防受潮。⑥真空泵要经常检查油面和油色,油面过低和油色发黑,则需换油,通常半年或一季度至少要换一次油。

(责任编辑:泉水)
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