首页 | 家园 | 百科 | 下载 | 书库 | 仪器 | 展会 |人才 | 公司 | 网址 | 问答 | 论坛 | 注册 | 通行证登录 | English

生物行

生物行   进展 | 摘要 | 人物 | 医药 | 疾病 | 技术 | 健康 | 能源   生物航   供应 | 求购 | 公司 | 展会 | 要发布
论坛   神经科学 | 神经系统疾病 | 实验技术 | 求职招聘 | 器材试剂 | 文献检索 | 读书笔记 | 考试招生 | 软件使用
当前位置: 主页 > 生物资源 > 考研考博 > 笔记 >

生化实验讲义(理论部分)四--电泳技术

时间:2005-12-31 22:42来源:Internet 作者:admin 阅读:

4.1 电泳技术发展简史
  1809年俄国物理学家Рейсе首次发现电泳现象。他在湿粘土中插上带玻璃管的正负两个电极,加电压后发现正极玻璃管中原有的水层变混浊,即带负电荷的粘土颗粒向正极移动,这就是电泳现象。
  1909年Michaelis首次将胶体离子在电场中的移动称为电泳。他用不同pH的溶液在U形管中测定了转化酶和过氧化氢酶的电泳移动和等电点。
  1937年瑞典Uppsala大学的Tiselius对电泳仪器作了改进,创造了Tiselius电泳仪,建立了研究蛋白质的移动界面电泳方法,并首次证明了血清是由白蛋白及α、β、γ球蛋白组成的,由于Tiselius在电泳技术方面作出的开拓性贡献而获得了1948年的诺贝尔化学奖。
  1948年Wieland和Fischer重新发展了以滤纸作为支持介质的电泳方法,对氨基酸的分离进行过研究。
  从本世纪50年代起,特别是1950年Durrum用纸电泳进行了各种蛋白质的分离以后,开创了利用各种固体物质(如各种滤纸、醋酸纤维素薄膜、琼脂凝胶、淀粉凝胶等)作为支持介质的区带电泳方法。
  1959年Raymond和Weintraub利用人工合成的凝胶作为支持介质,创建了聚丙烯酰胺凝胶电泳,极大地提高了电泳技术的分辨率,开创了近代电泳的新时代。30多年来,聚丙烯酰胺凝胶电泳仍是生物化学和分子生物学中对蛋白质、多肽、核酸等生物大分子使用最普遍,分辨率最高的分析鉴定技术,是检验生化物质的最高纯度:即“电泳纯”(一维电泳一条带或二维电泳一个点)的标准分析鉴定方法,至今仍被人们称为是对生物大分子进行分析鉴定的最后、最准确的手段,即“Last Check”。
  由80年代发展起来的新的毛细管电泳技术,是化学和生化分析鉴定技术的重要新发展,己受到人们的充分重视。
4.2 电泳的基本原理
  电泳是指带电颗粒在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物分子,如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可电离基团,它们在某个特定的pH值下可以带正电或负电,在电场的作用下,这些带电分子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。电泳技术就是利用在电场的作用下,由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异,使带电分子产生不同的迁移速度,从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。
  电泳过程必须在一种支持介质中进行。Tiselius等在1937年进行的自由界面电泳没有固定支持介质,所以扩散和对流都比较强,影响分离效果。于是出现了固定支持介质的电泳,样品在固定的介质中进行电泳过程,减少了扩散和对流等干扰作用。最初的支持介质是滤纸和醋酸纤维素膜,目前这些介质在实验室已经应用得较少。在很长一段时间里,小分子物质如氨基酸、多肽、糖等通常用滤纸或纤维素、硅胶薄层平板为介质的电泳进行分离、分析,但目前则一般使用更灵敏的技术如HPLC等来进行分析。这些介质适合于分离小分子物质,操作简单、方便。但对于复杂的生物大分子则分离效果较差。凝胶作为支持介质的引入大大促进了电泳技术的发展,使电泳技术成为分析蛋白质、核酸等生物大分子的重要手段之一。最初使用的凝胶是淀粉凝胶,但目前使用得最多的是琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。蛋白质电泳主要使用聚丙烯酰胺凝胶。
  电泳装置主要包括两个部分:电源和电泳槽。电源提供直流电,在电泳槽中产生电场,驱动带电分子的迁移。电泳槽可以分为水平式和垂直式两类。垂直板式电泳是较为常见的一种,常用于聚丙烯酰胺凝胶电泳中蛋白质的分离。电泳槽中间是夹在一起的两块玻璃板,玻璃板两边由塑料条隔开,在玻璃平板中间制备电泳凝胶,凝胶的大小通常是12cm  14 cm,厚度为1mm~2 mm,近年来新研制的电泳槽,胶面更小、更薄,以节省试剂和缩短电泳时间。制胶时在凝胶溶液中放一个塑料梳子,在胶聚合后移去,形成上样品的凹槽。水平式电泳,凝胶铺在水平的玻璃或塑料板上,用一薄层湿滤纸连接凝胶和电泳缓冲液,或将凝胶直接浸入缓冲液中。由于pH值的改变会引起带电分子电荷的改变,进而影响其电泳迁移的速度,所以电泳过程应在适当的缓冲液中进行的,缓冲液可以保持待分离物的带电性质的稳定。
  为了更好的了解带电分子在电泳过程中是如何被分离的,下面简单介绍一下电泳的基本原理。在两个平行电极上加一定的电压(V),就会在电极中间产生电场强度(E),L是电极间距离。
  在稀溶液中,电场对带电分子的作用力(F),等于所带净电荷与电场强度的乘积。
  这个作用力使得带电分子向其电荷相反的电极方向移动。在移动过程中,分子会受到介质粘滞力的阻碍。粘滞力(F’)的大小与分子大小、形状、电泳介质孔径大小以及缓冲液粘度等有关,并与带电分子的移动速度成正比,对于球状分子,F’的大小服从Stokes定律,即:
                 F’=6πrηυ
  式中r是球状分子的半径,η是缓冲液粘度,υ是电泳速度(υ= d / t,单位时间粒子运动的距离,cm / s )。当带电分子匀速移动时: F = F’,
               ∴  q•E = 6πrηυ
  由此可以看出,迁移率与带电分子所带净电荷成正比,与分子的大小和缓冲液的粘度成反比。
  用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量时,实际使用的是相对迁移率mR。
  带电分子由于各自的电荷和形状大小不同,因而在电泳过程中具有不同的迁移速度,形成了依次排列的不同区带而被分开。即使两个分子具有相似的电荷,如果它们的分子大小不同,由于它们所受的阻力不同,因此迁移速度也不同,在电泳过程中就可以被分离。有些类型的电泳几乎完全依赖于分子所带的电荷不同进行分离,如等电聚焦电泳;而有些类型的电泳则主要依靠分子大小的不同即电泳过程中产生的阻力不同而得到分离,如SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。分离后的样品通过各种方法的染色,或者如果样品有放射性标记,则可以通过放射性自显影等方法进行检测。
4.3 影晌电泳分离的主要因素
  由电泳迁移率的公式可以看出,影响电泳分离的因素很多,下面简单讨论一些主要的影响因素:
  1. 待分离生物大分子的性质
  待分离生物大分子所带的电荷、分子大小和性质都会对电泳有明显影响。一般来说,分子带的电荷量越大、直径越小、形状越接近球形,则其电泳迁移速度越快。
  2. 缓冲液的性质
  缓冲液的pH值会影响待分离生物大分子的解离程度,从而对其带电性质产生影响,溶液pH值距离其等电点愈远,其所带净电荷量就越大,电泳的速度也就越大,尤其对于蛋白质等两性分子,缓冲液pH还会影响到其电泳方向,当缓冲液pH大于蛋白质分子的等电点,蛋白质分子带负电荷,其电泳的方向是指向正极。为了保持电泳过程中待分离生物大分子的电荷以及缓冲液pH值的稳定性,缓冲液通常要保持一定的离子强度,一般在0.02-0.2,离子强度过低,则缓冲能力差,但如果离子强度过高,会在待分离分子周围形成较强的带相反电荷的离子扩散层(即离子氛),由于离子氛与待分离分子的移动方向相反,它们之间产生了静电引力,因而引起电泳速度降低。另外缓冲液的粘度也会对电泳速度产生影响。

3. 电场强度
  电场强度(V/cm)是每厘米的电位降,也称电位梯度。电场强度越大,电泳速度越快。但增大电场强度会引起通过介质的电流强度增大,而造成电泳过程产生的热量增大。电流在介质中所做的功(W)为:
              W=I2.R.t
  上式中:I为电流强度,R为电阻,t为电泳时间。
  电流所作的功绝大部分都转换为热,因而引起介质温度升高,这会造成很多影响:
  ①样品和缓冲离子扩散速度增加,引起样品分离带的加宽;②产生对流,引起待分离物的混合;③如果样品对热敏感,会引起蛋白变性;④引起介质粘度降低、电阻下降等等。电泳中产生的热通常是由中心向外周散发的,所以介质中心温度一般要高于外周,尤其是管状电泳,由此引起中央部分介质相对于外周部分粘度下降,摩擦系数减小,电泳迁移速度增大,由于中央部分的电泳速度比边缘快,所以电泳分离带通常呈弓型。降低电流强度,可以减小生热,但会延长电泳时间,引起待分离生物大分子扩散的增加而影响分离效果。所以电泳实验中要选择适当的电场强度,同时可以适当冷却降低温度以获得较好的分离效果。
  4. 电渗
  液体在电场中,对于固体支持介质的相对移动,称为电渗现象。由于支持介质表面可能会存在一些带电基团,如滤纸表面通常有一些羧基,琼脂可能会含有一些硫酸基,而玻璃表面通常有Si-OH基团等等。这些基团电离后会使支持介质表面带电,吸附一些带相反电荷的离子,在电场的作用下向电极方向移动,形成介质表面溶液的流动,这种现象就是电渗。在pH值高于3时,玻璃表面带负电,吸附溶液中的正电离子,引起玻璃表面附近溶液层带正电,在电场的作用下,向负极迁移,带动电极液产生向负极的电渗流。如果电渗方向与待分离分子电泳方向相同,则加快电泳速度;如果相反,则降低电泳速度。
  5. 支持介质的筛孔
  支持介质的筛孔大小对待分离生物大分子的电泳迁移速度有明显的影响。在筛孔大的介质中泳动速度快,反之,则泳动速度慢。
4.4 电泳的分类
⑴ 区带电泳:电泳过程中,待分离的各组分分子在支持介质中被分离成许多条明显的区带,这是当前应用最为广泛的电泳技术。
⑵ 自由界面电泳: 这是瑞典Uppsala大学的著名科学家Tiselius最早建立的电泳技术,是在U形管中进行电泳,无支持介质,因而分离效果差,现已被其他电泳技术所取代。
⑶ 等速电泳:需使用专用电泳仪,当电泳达到平衡后,各电泳区带相随,分成清晰的界面,并以等速向前运动。
⑷ 等电聚焦电泳:由两性电解质在电场中自动形成pH梯度,当被分离的生物大分子移动到各自等电点的pH处聚集成很窄的区带。
  按支持介质的不同可分为:
⑴ 纸电泳(Paper electrophorisis)
⑵ 醋酸纤维薄膜电泳(Cellulose Acetate electrophoresis)
⑶ 琼脂凝胶电泳(Agar Gel electrophoresis)
⑷ 聚丙烯酰胺凝胶电泳(Polyacrylamide Gel electrophoresis)(PAGE)
⑸ SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。
  按支持介质形状不同可它为:
⑴ 薄层电泳 ;   ⑵ 板电泳 ;   ⑶ 柱电泳。
  按用途不同可分为:
⑴ 分析电泳;  ⑵ 制备电泳;  ⑶ 定量免疫电泳; ⑷ 连续制备电泳。
  按所用电压不同可分为:
⑴ 低压电泳:100V~500V,电泳时间较长,适于分离蛋白质等生物大分子。
⑵ 高压电泳:1000V~5000V,电泳时间短,有时只需几分钟,多用于氨基酸、多肽、核苷酸和糖类等小分子物质的分离。
4.5 纸电泳和醋酸纤维薄膜电泳
  纸电泳是用滤纸作支持介质的一种早期电泳技术。尽管分辨率比凝胶介质要差,但由于其操作简单,所以仍有很多应用,特别是在血清样品的临床检测和病毒分析等方面有重要用途。
  纸电泳使用水平电泳槽。分离氨基酸和核苷酸时常用pH 2~3.5的酸性缓冲液,分离蛋白质时常用碱性缓冲液。选用的滤纸必须厚度均匀,常用国产新华滤纸和进口的Whatman 1号滤纸。点样位置是在滤纸的一端距纸边5cm~10cm处。样品可点成园形或长条形,长条形的分离效果较好。点样量为5g~100g和5l~10l。点样方法有干点法和湿点法。湿点法是在点样前即将滤纸用缓冲液浸湿,样品液要求较浓,不亦多次点样。干点法是在点样后再用缓冲液和喷雾器将滤纸喷湿,点样时可用吹风机吹干后多次点样,因而可以用较稀的样品。电泳时要选择好正、负极,电压通常使用2~10 V/cm的低压电泳,电泳时间较长。对于氨基酸和肽类等小分子物质,则要使用50~200 V/cm的高压电泳,电泳时间可以大大缩短,但必须解决电泳时的冷却问题,并要注意安全。
  电泳完毕记下滤纸的有效使用长度,然后烘干,用显色剂显色,显色剂和显色方法,可查阅有关书藉。定量测定的方法有洗脱法和光密度法。洗脱法是将确定的样品区带剪下,用适当的洗脱剂洗脱后进行比色或分光光度测定。光密度法是将染色后的干滤纸用光密度计直接定量测定各样品电泳区带的含量。
  醋酸纤维薄膜电泳与纸电泳相似,只是换用了醋酸纤维薄膜作为支持介质。将纤维素的羟基乙酰化为醋酸酯,溶于丙酮后涂布成有均一细密微孔的薄膜,其厚度为0.1~0.15mm。
  醋酸纤维薄膜电泳与纸电泳相比有以下优点:① 醋酸纤维薄膜对蛋白质样品吸附极少,无“拖尾”现象,染色后蛋白质区带更清晰。② 快速省时。由于醋酸纤维薄膜亲水性比滤纸小,吸水少,电渗作用小,电泳时大部分电流由样品传导,所以分离速度快,电泳时间短,完成全部电泳操作只需90 min左右。③ 灵敏度高,样品用量少。血清蛋白电泳仅需 2l 血清,点样量甚至少到0. 1l,仅含5g的蛋白样品也可以得到清晰的电泳区带。临床医学用于检测微量异常蛋白的改变。④ 应用面广。可用于那些纸电泳不易分离的样品,如胎儿甲种球蛋白、溶菌酶、胰岛素、组蛋白等。⑤ 醋酸纤维薄膜电泳染色后,用乙酸、乙醇混合液浸泡后可制成透明的干板,有利于光密度计和分光光度计扫描定量及长期保存。
由于醋酸纤维薄膜电泳操作简单、快速、价廉,目前已广泛用于分析检测血浆蛋白、脂蛋白、糖蛋白、胎儿甲种球蛋白、体液、脊髓液、脱氢酶、多肽、核酸及其他生物大分子,为心血管疾病、肝硬化及某些癌症鉴别诊断提供了可靠的依据,因而已成为医学和临床检验的常规技术。

(责任编辑:泉水)
------分隔线----------------------------
发表评论
请自觉遵守互联网相关的政策法规,严禁发布色情、暴力、反动的言论。
评价:
表情:
用户名: 验证码:点击我更换图片
栏目列表
推荐内容
  • 分子生物学笔记

    第一章 基因的结构 第一节 基因和基因组 一、基因(gene) 是合成一种功能蛋白或RNA分子...