一、实验目的
1. 了解凝胶层析的原理及其应用。
2. 通过测定蛋白质分子量的训练，初步掌握凝胶层析技术。
二、实验原理
凝胶层析又称排阻层析，凝胶过滤，渗透层析或分子筛层析等。它广泛地应用于分离、提纯、浓缩生物大分子及脱盐、去热源等，而测定蛋白质的分子量也是它的重要应用之一。凝胶是一种具有立体网状结构且呈多孔的不溶性珠状颗粒物质。用它来分离物质，主要是根据多孔凝胶对不同半径的蛋白质分子（近于球形）具有不同的排阻效应实现的。亦即它是根据分子大小这一物理性质进行分离纯化的。分离原理参见“理论部分的凝胶层析一节”。对于某种型号的凝胶，一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排阻在外，只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外；而一些小分子不被排阻，可自由扩散，渗透进入凝胶内部的筛孔，尔后又被流出的洗脱液带走。分子越小，进入凝胶内部越深，所走的路程越多，故小分子最后流出柱外，而大分子先从柱中流出。一些中等大小的分子介于大分子与小分子之间，只能进入一部分凝胶较大的孔隙，亦即部分排阻，因此这些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。这样样品经过凝胶层析后，分子便按照从大到小的顺序依次流出，达到分离的目的。
凝胶层析分离原理示意动画。
对于任何一种被分离的化合物在凝胶层析柱中被排阻的范围均在0～100%之间，其被排阻的程度可以用有效分配系数Kav（分离化合物在内水和外水体积中的比例关系）表示，Kav值的大小和凝胶柱床的总体积（Vt）、外水体积（V0）以及分离物本身的洗脱体积（Ve）有关：
Kav = (Ve－V0)/(Vt－V0) ----------- (1)
在限定的层析条件下，Vt和V0都是恒定值，而Ve是随着分离物分子量的变化而改变。分子量大，Ve值小，Kav值也小。反之，分子量小Ve值大，Kav值大。
有关凝胶层析柱中凝胶自身（基质）体积（Vg）、外水体积（V0）、内水体积（Vi）及柱床总体积（Vt）的参见示意图。


凝胶层析柱中的几种层析峰。

有效分配系数Kav是判断分离效果的一个重要参数，同时也是测定蛋白质分子量的一个依据。在相同层析条件下，被分离物质Kav值差异越大，分离效果越好。反之，分离效果差或根本不能分开。在实际的实验中，我们可以实测出Vt、V0及Ve的值，从而计算出Kav的大小。对于某一特定型号的凝胶，在一定的分子量范围内，Kav与logMw (Mw表示物质的分子量) 成线性关系：
Kav ＝－b logMw + C --------- (2)
其中 b,C为常数。
同样可以得到：
Ve ＝－b'logMw + C' --------- (3)
其中 b', C'为常数。即 Ve 与 logMw 也成线性关系。我们可以通过在一凝胶柱上分离多种已知分子量的蛋白质后，并根据上述的线性关系绘出标准曲线，然后用同一凝胶柱测出其它未知蛋白的分子量。
三、器材与试剂
（一）器材
1. 玻璃层析柱（(20mm×60cm）
2. 恒流泵（或下口恒压贮液瓶）
3. 自动部分收集器
4. 紫外分光光度计
5. 100ml试剂瓶
6. 1000ml量筒
7. 250ml烧杯
8. 50ml、100ml烧杯
9. 10ml（或5ml）刻度试管
（二）试剂
1. 标准蛋白
（1）牛血清白蛋白：Mw=67,000（上海生化所）
（2）鸡卵清清蛋白：Mw=45,000（美国SIGMA公司）
（3）胰凝乳蛋白酶原A：Mw=24,000（美国SIGMA公司）
（4）溶菌酶：Mw =14,300
2. 未知蛋白质样品：由实验室准备
3. 0.025M KCl－0.1M HAC(乙酸)（洗脱液1000ml）
4. 蓝色葡聚糖－2000
四、实验操作
（一）凝胶的溶胀
称取7g Sephadex G-75 于 250ml 烧杯中加入洗脱液100ml，置室温溶胀2～3天，反复倾泻去掉细颗粒，然后减压抽气去除凝胶孔隙中的空气，沸水浴中煮沸2～3小时（可去除颗粒内部的空气及灭菌）。
（二）装柱(realplay)
1. 取洁净的的玻璃层析柱垂直固定在铁架台上。
2. 凝胶柱总体积（Vt）的测定：
在距柱上端约 5cm 处作一记号，关闭柱出水口，加入去离子水，打开出水口，液面降至柱记号处即关闭出水口，然后用量筒接收柱中去离子水（水面降至层析柱玻璃筛板），读出的体积即为柱床总体积Vt。也可以最后走完未知蛋白后再测定Vt。
3. 在柱中注入洗脱液（约1/3柱床高度），将凝胶浓浆液缓慢倾入柱中，待凝胶沉积约1cm ～ 2cm 高度后打开出水口，流速一般用3ml～6ml / 10 min。胶面上升到柱记号处则装柱完毕，注意装柱过程中凝胶不能分层。然后关闭出水口，静置片刻，等凝胶完全沉降，则接上恒流泵，用1～2倍床体积的洗脱液平衡柱子，使柱床稳定。
（三）V0的测定(realplay)
吸去柱上端的洗脱液（切不要搅乱胶面，可复盖一张滤纸或尼龙网）。打开出水口，使残余液体降至 与胶面相切（但不要干胶），关闭出水口。用细滴管吸取０.5 ml（2mg/ml）蓝色葡聚糖—2000，小心地绕柱壁一圈（距胶面2mm）缓慢加入,然后迅速移至柱中央慢慢加入柱中，打开出水口（开始收集！），等溶液渗入胶床后，关闭出水口，用少许洗脱液加入柱中，渗入胶床后，柱上端再用洗 脱液充满后用3ml/10分钟的的速度开始洗脱。最后作出洗脱曲线。收集并量出从加样开始至洗脱液中蓝色葡聚糖浓度最高点的洗脱液体积即为V0。注意：蓝色葡聚糖洗下来之后，还要用洗脱液（１～２倍床体积）继续平衡一段时间，以备下步实验使用。
（四）标准曲线的制作
1. 用洗脱液配制标准蛋白溶液全班共用，溶液中四种蛋白的浓度各为：牛血清清蛋白（2.5mg/ml）、鸡卵清清蛋白（6.0mg/ml）、胰凝乳蛋白酶原A（2.5mg/ml）和溶菌酶（2.5mg/ml）。
2. 按（三）的操作方法加入上述标准蛋白溶液（0.5ml～1 ml），以1.5ml/管/5分钟的速度洗脱并收集洗脱液。
3. 用紫外分光光度计逐管测定 A280，并确定各种蛋白的洗脱峰最高点，然后量出各种蛋白的洗脱体积 Ve。由于每管只收集了1.5ml洗脱液，量比较少，因此比色时要加入一定量的洗脱液进行测定。（一般的比色杯可以盛装3ml溶液）。当然，也可以用微量比色杯进行测定。
4. 以 A280 为纵座标，Ve 为横座标画出标准蛋白的洗脱曲线。
5. 以 Kav 为纵座标，logMw 为横座标作图画出一条标准曲线。
6. 以 Ve 为纵座标，logMw 为横座标作图画出一条标准曲线。
（五）未知蛋白分子量的测定
测定方法同标准曲线制作的1.、2.、3. 步相同，然后在标准曲线上查得logMw,其反对数便是待测蛋白质的分子量。
注意： 实验完毕后，将凝胶全部回收处理，以备下次实验使用，严禁将凝胶丢弃或倒入水池中。

参考文献
1. 李建武等，《生物化学实验原理和方法》1994年
2. 赵永芳《生物化学技术原理及其应用》1994年
3. ROBERTL.DRYER & GENEF.LATA 《EXPERIMENTAL BIOCHEMISTRY》1989