一．实验目的
酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay 简称ELISA)是在免疫酶技术(immunoenzymatic techniques)的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术,ELISA过程包括抗原(抗体)吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体(抗原), 再加相应酶标记抗体(抗原),生成抗原(抗体)--待测抗体(抗原)--酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体(抗原)的量。待测抗体(抗原)的定量与有色产生成正比。
二．实验原理
（一） 酶的交联
用于免疫酶技术的酶有很多，如过氧化物酶，碱性磷酸酯酶，β－Ｄ－半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，乙酰胆碱酯酶，6－磷酸葡萄糖脱氧酶等。常用于ELISA法的酶有辣根过氧化物酶，碱性磷酸酯酶等，其中尤以辣根过氧化物酶为多。由于酶摧化的是氧化还原反应，在呈色后须立刻测定，否则空气中的氧化作用使颜色加深，无法准确地定量。辣根过氧化物酶交联在抗体上的方法主要有两种，即戊二醛法和过碘酸氧化法。
1．戊二醛法
戊二醛作为双活性试剂可将酶与抗体交联在一起，但戊二醛与蛋白质反应的机理各说 不一，有的认为可能形成Michael加合物：
也有人认为可能是产生不饱合醛，再与－NH2反应成双Schiff碱蛋白衍生物：

戊二醛交联法有一步法和二步法之分。一步交联法是把一定量的酶，抗体和戊二醛同加入溶液中，在一定温度下反应一段时间，然后用透析法或凝胶过滤除去未结合的戊二醛即可得到酶结合物。在蛋白质与戊二醛的交联反应中，蛋白质赖氨酸基团是戊二醛最可能的反应部位，组成辣根过氧化物酶（HRP）的300多个氨基酸中只有6个赖氨酸。市售的HRP中，只有1－2个赖氨酸基团可供交联，而抗体分子中，赖氨酸基团含量要大得多，因此在一步交联中，HRP反应性不强，抗体分子在戊二醛作用下易形成聚合物，因此交联反应后必须用50％饱和硫酸铵沉淀或用凝胶过滤除去聚合物。一步法酶结合物产率仅6－7％，其中HRP约占5％。在正常情况下，HRP只有一个戊二醛分子的一个醛基反应，而第二个醛基不能与同一个或其他酶反应，即不发生聚合，故可将戊二醛先与HRP反应，透析除去未反应的戊二醛，再加入抗体，这样就不会产生聚合现象，此为二部交联法。产生的酶结合物中，其酶和抗体的mol比接近1：1，标记活性的损失比一步法少，但该法效率也不高，仅有2－5％的HRP标记在抗体分子上，标记的抗体只占25％，酶结合物的产率仅为10－15％。在实际运用中，酶与抗体mol比在1－2之间为宜，但未标记的抗体严重干扰检测结果，常用聚丙烯酰胺－琼脂糖凝胶(Ultrogel ACA-4A)过滤法除去未标记的抗体，无上述凝胶，也可Sephadex G-200代替。

2．过碘酸盐氧化法
辣根过氧化物酶是一种带糖的酶。糖含量约占18％，过碘酸盐可将糖中的羟基氧化成醛基，再与抗体直接连接。然后加硼氢化钠还原形成稳定的酶结合物。该法交联效果比戊二醛法好，结合物中HRP与抗体的mol比在2－3之间，参与酶结合物中的HRP可达70％，而抗体则可达99％。但在标记过程中，酶活性和抗体的免疫活性损失较多。




用戊二醛交联时，戊二醛的质量至关重要。戊二醛易挥发，久置可发生聚合和氧化，降低交联作用。由于戊二醛单体的光吸收峰是280nm，而聚合体则在235nm，故新鲜的，保存得法的戊二醛其A235/A280nm的比值小于3。戊二醛应避光.低温保存。
辣根过氧化物酶（HRP）是一种糖蛋白，每个分子含有一个氯化血红素(protonhemin)区作辅基。酶的浓度和纯度常以辅基的含量表示。氯化血红素辅基的最大吸收峰是403nm，HRP酶蛋白的最大吸收峰是275nm，所以酶的浓度和纯度计算式是
酶结合物的A(1cm 403nm)×稀释倍数
HRP的A(1cm 403nm) 酶结合物中HRP浓度(mg/ml)＝

＝酶结合物的A(1cm 403nm) 0.4×稀释倍数
（已知HRP的A(1cm 403nm 1%)＝25，式中1％指HRP百分浓度为100ml含酶蛋白1g，即10mg/ml，所以，酶浓度以 mg/ml 计算是HRP的A(1cm 403nm mg/ml=2.5)
HRP纯度(RZ)=A403nm/A275nm
纯度RZ（Ｒeinheit Zahl）值越大说明酶内所含杂质越少。高纯度HRP的RZ值在3.0左右，最高可达3.4。用于ELISA检测的HRP的RZ值要求在3.0以上。

（二） 酶与底物
酶结合物是酶与抗体或抗原, 半抗原在交联剂作用下联结的产物。是ELISA成败的关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应，还具有酶促反应，显示出生物放大作用，但不同的酶选用不同的底物。

免疫技术常用的酶及其底物
酶 底 物 显色反应 测定波长/(nm) 辣根过氧化物酶
(HRP)



邻苯二胺(OPD)
3.3'.5.5'四甲替联苯胺(TMB)
5-氨基水杨酸(5-AS)
邻联苯甲胺(OT)
2,2'-连胺基-2(3-乙基-并噻
唑啉磺酸-6)铵盐(ABTS) 橘红色
黄色
棕色
兰色

蓝绿色 492*, 460**
450
449
425

642 碱性磷酸酯酶
4-硝基酚磷酸盐(PNP)
萘酚-AS－Mx磷酸盐+重氮盐 黄色
红色 400
500 葡萄糖氧化酶
ABTS+HRP+葡萄糖
葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰 黄色
深蓝色 405,420
β-Ｄ－半乳糖苷酶
4-甲基伞酮基-半乳糖苷(4MuG)
硝基酚半乳糖苷(ONPG) 荧光
黄色 360,450
420
* 终止剂为2mol/L H2SO4
** 终止剂为2 mol/L柠檬酸， 不同的底物有不同的终止剂。


可催化下列反应：
HRP+H2O2→复合物
复合物+AH2→过氧化物酶+H2O+A
AH2 ——为无色底物, 供氢体；
A—— 为有色产物。

（三） ELISA常用的四种方法
1． 直接法测定抗原
A. 将抗原吸附在载体表面；
B. 加酶标抗体，形成抗原—抗体复合物；
C. 加底物。底物的降解量＝抗原量。
2．间接法测定抗体
A. 将抗原吸附于固相载体表面；
B. 加抗体, 形成抗原-抗体复合物;
C. 加酶标抗体；
D. 加底物。 测定底物的降解量＝抗体量。
3．双抗体夹心法测定抗原
A. 将抗原免疫第一种动物获得的抗体吸附于固相表面;
B. 加抗原，形成抗原-抗体复合物;
C. 加抗原免疫第二种动物获得的抗体，形成抗体抗原抗体复合物;
D. 加酶标抗抗体(第二种动物抗体的抗体);
E. 加底物。底物的降解量＝抗原量。
4. 竞争法测定抗原
A. 将抗体吸附在固相载体表面;
B.(1) 加入酶标抗原；
B.(2),(3)加入酶标抗原和待测抗原；
C. 加底物。对照孔与样品孔底物降解量的差＝未知抗原量。


三．仪器和材料
1. 聚苯乙烯微量细胞培养板(平板, 40, 96孔)。

2. 酶联免疫检测仪
3. 辣根过氧化物酶羊抗兔IgG, 工作稀释度1:1000。
4. 包被液:：0.05mol/L pH9.6碳酸缓冲液,4℃，保存,　Na2CO3 0.15克, NaHCO3 0.293克,蒸馏水稀释至100 ml。
5. 稀释液：0.01mol/LpH7.4 PBS--Tween--20, ４℃，保存. NaCl 8g, KH2PO4 0.2g, Na2HPO4.12H2O 2.9g, Tween—20，0.5ml. 蒸馏水加至1000ml。
6. 洗涤液：同稀释液
7. 封闭液：0.5%鸡卵清蛋白，pH7.4 PBS。
8. 邻苯二胺溶液(底物)：临用前配制 0.1M 柠檬酸(2.1g/100ml), 6.1ml 0.2M Na2HPO4.12H2O　(7.163g/100ml)　6.4ml, 蒸馏水12.5ml, 邻苯二胺10mg, 溶解后, 临用前加30%H2O2 40 微升。
9. 终止液：2mol/LH2SO4。


四. 操作步骤
1. 包被抗原：用包被液将抗原作适当稀释, 一般为1～10微克/孔，每孔加200微升，37℃温育1小时后，4℃冰箱放置16～18小时。
2. 洗涤：倒尽板孔中液体，加满洗涤液，静放三分钟，反复三次，最后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽。
3. 加封闭液200微升，37℃放置一小时。
4. 洗涤同2。
5. 加被检血清：用稀释液将被检血清作几种稀释,，每孔200微升。同时作稀释液对照。37℃放置2小时。
6. 洗涤同2。
7. 加辣根过氧化物酶羊抗兔IgG, 每孔200微升, 放置37℃ 1小时。
8. 洗涤同2。
9. 加底物：邻苯二胺溶液加200ml，室温暗处10--15分钟。
10. 加终止液：每孔50微升。
11. 观察结果：用酶联免疫检测仪记录490nm读数。